Ingeniería y validación funcional del canal Kv2.1-HaloTag para el estudio del tráfico de variantes mutantes

Abstract

Las encefalopatías epilépticas son trastornos neurológicos graves causados principalmente por mutaciones en canales iónicos. Destacan las variantes mutantes del gen KCNB1 (canal de potasio Kv2.1) asociadas a epilepsias refractarias y cuya alta heterogeneidad y posibles defectos de proteostasis y tráfico intracelular complican su caracterización funcional. Debido a esto, surge la necesidad de desarrollo de una tecnología de marcaje más adecuada para estudios en célula viva que la inmunocitoquímica. En este trabajo se diseñó y evaluó una construcción plasmídica del canal Kv2.1 con inserción de la etiqueta HaloTag en posición G221. Ensayos funcionales de patch-clamp demostraron que dicha inserción no altera la actividad ni las propiedades biofísicas del canal respecto al silvestre (Kv2.1-WT). Además, mediante microscopía confocal se validó la funcionalidad del sistema Kv2.1-Halo permitiendo monitorizar la expresión y localización temporal del canal, así como procesos activos de tráfico intracelular, por lo que el sistema ayudaría en la caracterización de variantes KCNB1 patológicas.

Epileptic encephalopathies are severe neurological disorders primarily caused by ion channel mutations. Notably, KCNB1 (Kv2.1 potassium channel) gene variants are linked to refractory epilepsies, whose high heterogeneity and potential proteostasis and intracellular trafficking defects complicate their functional characterization. Therefore, it is necessary to develop a precise labeling system more suitable for live-cell studies than immunocytochemistry. In this study, a chimeric plasmid construct of the Kv2.1 channel was designed and evaluated by inserting a HaloTag domain into position G221. Patch-clamp assays demonstrated that this insertion did not alter the functionality nor biophysical properties of the channel compared to the wild type (Kv2.1-WT). Furthermore, confocal microscopy assays validated the Kv2.1-Halo system, enabling the monitoring of channel expression, temporal dynamics and active intracellular trafficking processes thereby supporting the characterization of pathological KCNB1 variants.