Función de LSECtin en el control de la inflamación durante la enfermedad hepática crónica

Abstract

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La cirrosis hepática es considerada un problema de salud pública grave generando una gran carga sobre los sistemas sanitarios debido a su cronicidad y más de 1 millón de muertes anuales. La progresión de la cirrosis se asocia con una disfunción inmunológica que, entre otros factores, implica la pérdida de mecanismos de tolerancia, determinados por las células presentadoras de antígeno (APCs) que pueblan el hígado, entre las que se encuentran las células endoteliales del sinusoide hepático (LSECs). Por su posición, interactúan constantemente con leucocitos circulantes en los cuales inducen un efecto de inactivación en condiciones de homeostasis gracias a los distintos receptores inmunitarios innatos que expresan. Dentro de estos receptores destaca la lectina de tipo C específica de LSECs LSECtin, conocida por participar en la regulación del sistema inmunitario hepático. Resultados previos de este laboratorio sugieren que esta proteína podría jugar un rol importante durante la enfermedad hepática crónica, donde su pérdida podría estar implicada en la progresión de la inflamación. En ese sentido, los objetivos de este trabajo fueron dilucidar los mecanismos que regulan la expresión de LSECtin en homeostasis y en cirrosis, así como esclarecer los mecanismos mediante los cuales LSECtin modula el sistema inmunitario. MÉTODOS En esta tesis doctoral hemos realizado experimentos con modelos animales de cirrosis experimental, apoyándonos con resultados obtenidos de muestras de patients cirróticos. En cuanto al modelo animal, indujimos daño hepático mediante la administración intragástrica de CCl₄. Esto nos permitió evaluar los cambios en LSECtin y su relación con la extensión del daño hepático, además de los efectos en la biología de las LSECs aisladas por cell sorting. Adicionalmente, el daño hepático resultante lo comparamos con animales que mantenían niveles altos de LSECtin durante la cirrosis gracias a un modelo genético de sobreexpresión (Ki). Mediante citometría de flujo examinamos las diferencias cuantitativas de los distintos compartimentos del sistema inmunitario hepático. Finalmente, exploramos el mecanismo molecular a través del cual actúa LSECtin sobre los linfocitos mediante ensayos in vitro. Al disponer tanto de LSECtin recombinante soluble, así como de un anticuerpo funcional anti-LAG3 que bloqueaba las interacciones con sus ligandos, pudimos explorar los efectos de esta lectina sobre la capacidad de diferenciación de los linfocitos y las vías de transducción implicadas en el proceso. RESULTADOS En el primer estudio comprobamos que tanto en pacientes como en animales cirróticos existía una pérdida de la expresión de LSECtin en el endotelio hepático comparado con animales control y sujetos sanos. Además, estas LSECs promovían respuestas proinflamatorias en lugar de tolerogénicas. Comprobamos también que detrás de los cambios de expresión de esta lectina se encontrarían las citocinas. Las proinflamatorias la reprimían, mientras que las antiinflamatorias la inducían, sugiriendo un posible mecanismo de recuperación de la homeostasis durante la cirrosis. En el segundo trabajo, y para explorar este escenario, estudiamos los efectos de mantener niveles altos de LSECtin en el modelo Ki. La sobreexpresión de LSECtin mitigaba la progresión de la fibrosis y el daño inflamatorio. Concretamente, observamos una modulación de las poblaciones linfocitarias con un aumento de Tregs en detrimento de las Th17. Tras comprobar que tanto en el modelo animal como los pacientes encontrábamos Th17 con niveles altos de LAG3, ligando conocido de LSECtin, demostramos cómo esta lectina prevenía su diferenciación, alterando la señalización del TCR y de la IL-6 que eran cruciales en este proceso. CONCLUSIONES La pérdida de expresión de LSECtin se encuentra involucrada en la progresión de la inflamación durante la cirrosis hepática. Su papel como modulador de poblaciones linfocitarias proinflamatorias a través de LAG3, así como la posibilidad de recuperar su expresión en cirrosis mediante el uso de citocinas la convierten en una diana con potencial interés terapéutico en esta patología.

BACKGROUND AND OBJECTIVES Liver cirrhosis is considered a serious public health problem generating a major burden on our health sector due to its chronicity and more than 1 million deaths annually. The progression of cirrhosis is associated with an immune dysfunction, which involves the loss of different tolerance mechanisms determined by the antigen-presenting cells (APCs) that populate the liver, among which the liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) stand out. Due to their location, they constantly interact with circulating leukocytes in which they induce an inactivating effect under homeostatic conditions through the different innate immune receptors they express. One of these receptors is the LSEC-specific C-type lectin LSECtin, known for its role in the regulation of the hepatic immune system. Previous results from this laboratory suggest that this protein could play an important role during chronic liver diseases, where its loss has been associated with the progression of inflammation. Thus, the objectives of this work were to elucidate the mechanisms by which LSECtin is regulated in homeostasis and disease as well as to ascertain how LSECtin mechanistically modulates the immune system. METHODS We have performed experiments with animal models of experimental cirrhosis supported by results obtained from samples of cirrhotic patients. Regarding the animal model, we induced liver damage by the intragastric administration of CCl₄. This allowed us to evaluate the changes in LSECtin expression, the relationship of these changes with the extent of liver damage and their effects on the biology of LSECs isolated by cell sorting. Additionally, we compared the magnitude of liver damage in animals that maintained high levels of LSECtin during cirrhosis using a genetic model of LSECtin overexpression (Ki). Using flow cytometry, we examined the quantitative differences in the various compartments of the hepatic immune system. Finally, we explored in vitro assays the molecular mechanism through which LSECtin acts on lymphocytes. By having both soluble recombinant LSECtin, as well as a functional anti-LAG3 antibody that blocked interactions with its ligands, we were able to explore the effects of this lectin on the differentiation capabilities of lymphocytes and the transduction pathways involved in those processes. RESULTS In the first study we found a loss of LSECtin expression in the hepatic endothelium of cirrhotic mice and patients compared to control mice and healthy volunteers, respectively. LSECs had a compromised signalling, promoting proinflammatory rather than tolerogenic responses. In addition, we found that proinflammatory cytokines repressed the expression of this lectin, while anti-inflammatory cytokines induced it, suggesting a possible mechanism of recovery of homeostasis during cirrhosis. In the second study, and to explore this scenario, we focused on evaluating the effects of maintaining high levels of LSECtin during this pathology in the Ki model. We found that LSECtin overexpression mitigated fibrosis progression and inflammatory damage. Specifically, we observed a modulation of lymphocyte populations with an increase in Tregs at the expense of Th17 cells. After verifying that Th17 cells from cirrhotic animals and patients highly expressed LAG3, a known ligand of LSECtin, we demonstrated how this lectin prevented their pro-inflammatory differentiation, altering the TCR and IL-6 signalling, also crucial for the Th17 phenotype. CONCLUSIONS The loss of LSECtin expression is involved in the progression of inflammation during liver cirrhosis. Its role as a modulator of proinflammatory lymphocyte populations through LAG3, as well as the possibility of recovering its expression in cirrhosis using cytokines, underscore LSECtin as a target of potential therapeutic interest in this pathology.