Cambios a nivel epigenético y proteómico en pez cebra en respuesta a la infección con virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV)

Abstract

El sistema inmune es el encargado de generar una respuesta frente a moléculas extrañas en el organismo, y está dividido en dos ramas: el sistema inmune innato y el sistema adaptativo. El sistema inmune innato constituye la primera línea de defensa contra organismos invasores o patógenos incluyendo bacterias, hongos y virus. En el caso de los virus la detección temprana de la infección viral por parte del organismo es crucial, para intentar bloquear la replicación y la propagación viral, antes de que se produzca un daño irreparable. En lo que se refiere a los peces, esta respuesta está orquestada por células (monocitos/macrófagos y natural killer), componentes moleculares, químicos y físicos que son capaces de orquestar una respuesta inmune innata para combatir la presencia del patógeno. Las enfermedades virales son algunas de las que más afectan el desarrollo de la acuicultura, y específicamente las causadas por los rhabdovirus, entre estos destaca el virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV), por ser uno de los virus que ocasiona mayores pérdidas económicas. Aunque no es un hospedador natural de SVCV el pez cebra es susceptible a su infección, por lo que lo hemos empleado como modelo de estudio. Es por ello que realizamos un estudio combinado dirigido al análisis de las posibles alteraciones epigenéticas provocadas por la infección del SVCV, así como el estudio del perfil proteómico establecido en las proteínas de suero de peces infectados con este virus. En el primer capítulo de esta memoria estudiamos la posibilidad de que la infección con SVCV, provocara la inducción de cambios epigenéticos en las histonas asociadas al ADN. En nuestro caso dirigimos el estudio al análisis de las metilaciones en la histona 3 sobre el cuarto residuo de lisina del extremo N‐terminal de la histona H3, que está estrechamente asociada con los promotores de los genes activos. A partir de muestras de órganos internos procedentes de peces infectados, que resultaron activados de forma persistente (con incremento superior a 1.5 veces) sobre controles no infectados y específicamente aquellos que estuviesen asociados a la respuesta inmune innata. Los resultados obtenidos permitieron identificar aquellos conjuntos de genes que estaban mayormente activados en cada uno de los grupos generados (1, 2 y 5 días post infección) y que nos proporcionaron indicios acerca de los procesos celulares que se desatan tras la aparición de una infección y la consecuente elaboración de una respuesta antiviral. Entre estos: la detección de patógenos a través de los tlrs, la de la señalización de citoquinas inflamatorias como el tnf‐ α, de proteínas de carácter antiviral como el interferón, la activación de moléculas como las CRP que también están vinculadas al sistema inmune innato y el establecimiento de la apoptosis como mecanismo de muerte celular. De igual forma se observó que entre los genes más activados por la infección con SVCV se encontraban aquellos relacionados con el reconocimiento de patógenos, citoquinas, interferones y otras moléculas con actividad antiviral descritas en la literatura. El segundo capítulo está dirigido al estudio del perfil proteómico establecido por las proteínas presentes en suero de peces cebra infectados con SVCV. Uno de los síntomas descritos para las infecciones con SVCV en los peces es la presencia de hemorragias, y alto contenido de ascitis, por lo que es lógico pensar que la infección viral causará la aparición o cambios de las proteínas circulantes en sangre. De ahí que nuestro interés en esta parte del trabajo estuviese dirigido a la identificación a diferentes de proteínas en plasma de pez cebra infectados a diferentes tiempos post infección con SVCV. Además de la identificación de proteínas habitualmente mayoritarias en plasma, resultó interesante la identificación de las vitelogeninas y de la proteína del gen 2 inducido por reovirus de carpa (Gig2), que mostraron un mayor incremento respecto a los peces control. Esta es la primera vez que se describe la presencia de la proteína Gig2 en suero de peces infectados. Igualmente se encontraron niveles elevados de proteínas relacionadas con proceso de apoptosis, así como otras relacionadas con la activación del complemento y la cascada de coagulación, lo que parece indicar un intento de resistencia a las hemorragias inducidas por la infección viral. Teniendo en cuenta que se ha descrito que la memoria de la respuesta innata es, en principio, inespecífica, decidimos evaluar la posibilidad de que una molécula inmunomoduladora de origen fúngico pudiera establecer un estado antiviral duradero en pez cebra, dando lugar a lo que muchos han llamado “inmunidad entrenada”. Los resultados revelaron que, tanto in vitro como in vivo, existe un conjunto de genes relacionados con el sistema inmune innato que son estimulados tras la administración de betaglucanos y esto conduce a un incremento de la supervivencia frente a infecciones de SVCV. El abordaje conjunto de epigenética y proteómica nos ha permitido corroborar la participación en la respuesta anti‐SVCV de genes, algunos ya descritos en otros modelos pez/virus, e identificar otros nuevos (gig2l).

Many economically important freshwater fish suffer diseases caused by viruses, which results in tremendous losses in aquaculture. The outcome of the virus infection relays in the virus ability to overcome the host antiviral response. In recent years transcriptomics and proteomics techniques have come up as novel tools to provide a comprehensive understanding of the specific molecular processes involved in the response of the infected fish to the pathogen and its relationship to disease resistance. Pathogens such as viruses can modulate the host transcriptome and proteome through a variety of mechanisms. Host chromatin can be one of the targets of the pathogen leading to changes during the course of infection. Methylation is a common type of histone modification. Different histone methylation states are a reflection of the epigenetics changes that may happen after challenge with a pathogen. In this study, chromatin extracted from internal organs of SVCV‐infected zebrafish was analyzed. We found over 7000 differentially methylated genes at 1, 2 and 5 days’ post challenge. Analysis of ChIP‐seq data revealed that several cell signaling pathways are transcriptionally activated in the infected fish: TGF‐β signaling, TLR´s signaling pathways and apoptosis response, amongst others. Those pathways represent different responses of the host to external/pathogen stimuli. QRT‐PCR was performed to verify the transcriptional activation of those genes identified by ChIPseq analysis. A number of genes reported to play a role in the innate immune response were shown to be up‐regulated: TLRs, pro‐inflammatory cytokines, interferon, c‐reactive proteins, gig2, mx, tlrs. Overall there is a significant activation of cytokine signaling, interleukin pathways from day 2 post‐infection. GSEA analysis indicated that proteosome degradation, TGF‐beta and TNF pathways are differentlially up‐regulated in the SVCVinfected fish. At the 5 dp.i. time point the apoptosis pathway as well as serum crps are the gene sets with the highest level of expression. To investigate the molecular mechanisms underlying SVCV pathogenesis samples from zebrafish blood were subjected to proteomic analysis. Our data revealed 139, 63, 32 altered host serum proteins at 1, 2 and 5 days p.i., respectively. Particularly, vitellogenins and gig2 are present in large quantities in blood from virus‐infected fish. Fish response to SVCV infection appears to occur rapidly, with the expression values of 20 proteins in the category of response to stimuli peaking at 24 hp.i. This number declined at later times postinfection. Moreover, up‐regulation of the corresponding genes were validated by qRT‐PCR, which further demonstrated raising levels of vitellogenins and gig2. Higher serum concentrations of vitellogenin protein in the SVCV‐infected fish was confirmed by immunoblot. This is the first report of an increase of vitellogenin and gig2 blood levels after viral infection of fish. To get further insight into the non‐specific innate immune response to pathogens as well as to examine the capacity of fish to gain a innate immune memory (trained immunity), the immunostimulatory potential of beta‐glucan and how it affects SVCV infection was analyzed both in vitro and in vivo. In a zebrafish cell line beta‐glucan treatment led to a rapid induction of a number of cytokines. Real‐time PCR data showed up‐regulation of il1b, il6, il8, il10, tnfa and gig2 genes. All these molecules are involved in the interferon‐signalling pathways as well as in response to pathogen pathways. In vivo, intraperitoneal injection of a single dose of beta‐glucan conferred partial protection against challenge with SVCV. Examination of the up‐regulated genes in the SVCV‐infected fish showed increased transcription of il1b, il6, il8, il10, tnfa and gig2 genes in the bea‐glucan treatment group, exhibiting a good correlation with the cell culture data and pointing to a link between a general activation of the innate immune system and the establishment of a temporary antiviral state in the fish. We believe this work makes an important contribution to the understanding of the cellular and molecular basis of defense against viral pathogens in teleost fish.