Estudio del estado conformacional del filtro de selectividad del canal KcsA en condiciones de inactivación

Abstract

En este trabajo se estudió el estado conformacional del filtro de selectividad del canal KcsA en condiciones de inactivación. En primer lugar, se expresó y purificó la proteína. Posteriormente, mediante la técnica de fluorescencia se estudió su estructura terciaria. A continuación, se determinaron las constantes de disociación aparentes, KD, de los cationes Na+ y K+ al filtro de selectividad de KcsA, a través de la caracterización de la desnaturalización térmica de la proteína. Los resultados indicaron la presencia de dos sitios de unión para el ion K+ (alta afinidad y baja afinidad) y un sitio de unión para ión Na+ al igual que lo publicado para el canal KcsA en condiciones de reposo (pH 7). Sin embargo, los valores de la KD determinados para pH 4 indicaron una disminución de la afinidad de K+ en el primero evento de unión y un aumento de la afinidad en el segundo evento de unión comparados con el pH 7. Estos resultados sugieren que la inactivación de KcsA conllevaría solo ligeros cambios en la estructura del filtro de selectividad respecto al estado de reposo

In this work, the conformational state of the KcsA channel selectivity filter under inactivation conditions was studied. Firstly, the KcsA channel protein was expressed and purified. Secondly, through the fluorescence technique, its tertiary structure was studied. Next, the apparent dissociation constants, KD, of the Na+ and K+ cations were determined through the thermal-induced denaturation of the protein. The results indicated the presence of two binding sites for the K+ ion (high affinity and low affinity) and one ion binding site for Na+ as previously reported for KcsA channel under resting conditions (pH 7). However, KD values determined for pH 4 showed a decrease in K+ affinity at the first binding event and an increase in affinity at the second binding event compared to pH 7. These results suggest that KcsA inactivation would only lead to slight changes in the selectivity filter structure with respect to the resting condition