Análisis de la localización subcelular de la proteína VCC de Arabidopsis y del efecto de las condiciones de cultivo sobre el fenotipo del mutante vcc-2

Abstract

Se han publicado descripciones discrepantes del fenotipo del mutante vasculature complexity and connectivity-2 (vcc-2) y de la localización subcelular de la proteína VCC de Arabidopsis. Roschzttardtz et al. (2014) y Yanagisawa et al. (2021) afirmaron que el patrón de venación de los cotiledones de vcc-2 es más simple e inconexo que el silvestre, y que VCC se localiza en la membrana celular. Según Wilson-Sánchez et al. (2018), las hojas de vcc-2 muestran asimetría bilateral, y VCC radica en el retículo endoplásmico. Hemos intentado establecer si tales discrepancias se deben a diferentes condiciones de cultivo o a diseños erróneos de los transgenes obtenidos para la visualización de proteínas de fusión entre VCC y una proteína fluorescente. Hemos comprobado que la temperatura y el fotoperiodo no modifican el patrón de venación de los cotiledones ni la simetría bilateral de las hojas de los mutantes estudiados, excepto vcc-2, cuya asimetría bilateral se incrementó en medios gelificados con Gelrite. Nuestro análisis mediante microscopía confocal de superresolución reveló que la proteína de fusión VCC:CFP es aparentemente citoplásmica. También hemos diseñado e iniciado la construcción de las fusiones traduccionales 35Spro:GFP:VCC (con la GFP unida al extremo amino de VCC en la proteína de fusión resultante) y 35Spro:VCC:YFP (con una proteína fluorescente más fotoestable y adecuada para la nanoscopía que la GFP).

Two distinct descriptions have been published of the phenotype of the vasculature complexity and connectivity-2 (vcc-2) Arabidopsis mutant, as well as of the subcellular localization of the VCC protein. Roschzttardtz et al. (2014) and Yanagisawa et al. (2021) claimed that the venation pattern of vcc-2 cotyledons is simpler and disconnected compared to wild type, and that VCC localizes at the cell membrane. According to Wilson-Sánchez et al. (2018), vcc-2 leaves exhibit bilateral asymmetry, and VCC localizes at the endoplasmic reticulum. We attempted to establish whether these discrepancies are due to different growth conditions or defective design of the transgenes used for obtaining and visualizing VCC fusion proteins. We confirmed that temperature and photoperiod do not modify the venation pattern of cotyledons or the bilateral symmetry of the studied mutants, except for vcc-2, whose leaf bilateral asymmetry increased in media gelified with Gelrite. Our super-resolution confocal microscopy analysis revealed that VCC:CFP is apparently cytoplasmic. We also designed and initiated the construction of the translational fusions 35Spro:GFP:VCC (with GFP attached to the N-terminus of VCC in the resulting fusion protein) and 35Spro:VCC:YFP (with a fluorescent protein more photostable and suitable for nanoscopy than GFP).