Matrices 3D de fosfato tricálcico-silicocarnotita con micro-/nano-estructura eutectoide y formación in situ de apatito

Abstract

Las opciones terapéuticas para el tratamiento de las patologías óseas constituyen uno de los principales retos en salud pública hoy en día, por lo que se hace necesario el desarrollo de nuevas estrategias para la reconstrucción y/o sustitución del tejido óseo. En la presente Tesis Doctoral se desarrollaron matrices 3D bifásicas de silicocarnotita y α-TCP con posibles aplicaciones en ITO. Estas se obtuvieron mediante el método de réplica sobre esponja polimérica a partir de un polvo cerámico de composición eutectoide dentro del subsistema Silicocarnotita-TCP contenido en el sistema Silicato dicálcico -TCP. Las matrices se caracterizaron desde el punto de vista mineralógico, físicoquímico, macro-/micro-/nano-estructural y biológico. Se utilizaron diversas técnicas de caracterización como: XRD, EDS, ATR-FTIR, espectroscopía Raman, porosimetría de mercurio, SEM, y TEM-SAD. Las matrices 3D presentaron una composición mineralógica de silicocarnotita (53.6% en peso) y α-TCP (46.4% en peso) muy próxima al punto invariante eutectoide (53.4/46.6) del subsistema Silicocarnotita - TCP. Los resultados confirmaron la posibilidad de controlar la macro-/micro-/nanoestructura de las matrices mediante la selección de la plantilla de poliuretano (25, 30 y 40 ppi) y el tratamiento térmico adecuado. En todos los casos se obtuvieron matrices 3D con estructuras porosas altamente interconectadas (83-96%) y una micro-/nano-estructura eutectoide formada por lamelas alternas de silicocarnotita y α-TCP. Mediante la velocidad de enfriamiento a través de la temperatura eutectoide (50°C/h, 16.5°C/h, 5.5°C/h) se controló el tamaño de las lamelas así como la resistencia a la compresión axial de las matrices, con valores que variaron desde 100-250 nm y 0.62 ± 0.07 MPa para una velocidad de enfriamiento de 50°C/h hasta 600-940 nm y 3.38 ± 0.06 MPa para una velocidad de enfriamiento de 5.5°C/h. Para evaluar la posible aplicación de las matrices 3D en ITO se realizaron ensayos de bioactividad y biocompatibilidad in vitro. Los ensayos de bioactividad se llevaron a cabo según la norma ISO/FDIS 23317 por inmersión de las matrices en SBF a diferentes tiempos (1-21 días). Los ensayos de biocompatibilidad se llevaron a cabo cultivando las ah-MSCs sembradas en las matrices a diferentes tiempos (7-28 días) y en diferentes medios de cultivo (GM y OM). Los ensayos de bioactividad mostraron que las matrices 3D reaccionan en SBF disolviendo la fase de silicocarnotita y desarrollando una nanoestructura porosa de HA por transformación pseudomórfica de las lamelas de α-TCP. A continuación, y tras 21 días de inmersión en SBF, se produce la precipitación de una capa densa de HA sustituido con silicio sobre las matrices previamente transformadas. Los estudios de biocompatibilidad mostraron que las ah-MSCs fueron capaces de adherirse y proliferar en estrecho contacto con las matrices 3D. Los ensayos AB confirmaron que el número de células y su actividad metabólica aumentaron con el tiempo de cultivo hasta los 28 días. El incremento de la actividad de la ALP con el tiempo de cultivo y la formación de nanofibras tipo colágeno con depósitos minerales sugirieron la posible diferenciación de las ah-MSCs en osteoblastos y la subsecuente formación de matriz extracelular mineralizada. Una posible biofuncionalización con moléculas de interés para la regeneración de tejido óseo se evaluó a través de la unión de la enzima ALP con las matrices 3D. La ALP se injertó con éxito manteniendo su actividad enzimática tras 21 días de funcionalización. Finalmente se comparó la micro-/nano-estructura de las matrices 3D obtenidas con la micro-/nano-estructura de un hueso trabecular natural de epífisis femoral de cerdo adulto. Se concluyó que las matrices 3D presentaron una composición química y una estructura muy similar a la del hueso trabecular natural examinado (porosidad, tamaño de poro y lamelas alternas con orientación aleatoria). Para los ensayos biológicos se contó con la aprobación del Comité de Ética de la Universidad Católica San Antonio de Murcia (Referencia CE051904). Por todo lo expuesto se puede concluir que las matrices 3D bifásicas desarrolladas en la presente Tesis Doctoral tienen una potencial aplicación en ITO.

Today’s, the therapeutic options in bone pathology constitute one of the main challenges for public health. Therefore, it is necessary to development new strategies for bone tissue reconstruction and replacement. In the present Doctoral Thesis, 3D biphasic scaffolds of silicocarnotite and α-TCP were developed with possible applications in bone tissue engineering. Scaffolds were obtained by polymer replica method from a ceramic powder with eutectoid composition within the subsystem Silicocarnotite-TCP and enclosing in the system Dicalcium silicate-TCP. Scaffolds were characterized from the mineralogical, physico-chemical, structural and biological point of view. Several characterization techniques were used such as: XRD, EDS, ATR-FTIR, Raman spectroscopy, mercury porosimetry, SEM and TEM-SAD. The 3D scaffolds presented a mineralogical composition of silicocarnotite (53.6 wt%) and α-TCP (46.4 wt%), which came very close to the eutectoid invariant point (53.4/46.6) within the subsystem Silicocarnotite-TCP. The results confirmed the possibility to control the macro-/micro-/nano-structure of scaffolds by the selection of the polyurethane template (25, 30 and 40 ppi) and the suitable heat treatment. In all cases, biphasic 3D scaffolds with highly interconnected porous structures (83-96%) and a eutectoid nanostructure formed by alternating lamellae of silicocarnotite and α-TCP were obtained. It was possible to control the lamellar size and axial compressive strength of the scaffolds by the cooling rate used via the eutectoid temperature, with values that varying from 100-250 nm and 0.62 ± 0.07 MPa for a cooling rate of 50°C/h to 600-940 nm and 3.38 ± 0.06 MPa for a cooling rate of 5.5°C/h. In order to evaluate the possible application of the 3D scaffolds in bone tissue engineering, their bioactivity and biocompatibility were studied in vitro. The bioactivity test was assessed by the scaffolds immersion in SBF at different times (1-21 days), according to Standard ISO / FDIS 23317. The biocompatibility tests were performed by incubating the ah-MSCs seeded on the 3D scaffolds at different times (7-28 days) and two culture media (GM and OM). The bioactivity test showed that the 3D scaffolds, when placed in SBF, react firstly by dissolving the silicocarnotite phase and then developing a HA porous structure by pseudomorphic transformation of α-TCP lamellae. Afterwards, silicon substituted HA precipitation formed a dense layer on the previously transformed scaffolds after 21 days of immersion in SBF. In vitro cell tests showed that the ah-MSCs were capable to adhere and proliferate in close contact with the 3D scaffolds. AB assays indicated that the number of cells and their metabolic activity increased with culture time up to 28 days. Increase in the ALP activity and the formation of collagen-like nanofibers meshwork together with mineral deposits suggested the possible differentiation of the ah-MSCs into osteoblasts and the subsequent formation of mineralized extracellular matrix. The possible biofunctionalization with molecules involved in bone tissue regeneration was evaluated by ALP enzyme bonding on the 3D scaffolds. ALP was successfully grafted onto scaffolds, whose enzymatic activity was maintained after 21 days of functionalization. Finally, a comparative SEM study between the bioinspired 3D scaffolds and natural cancellous bone of adult pig distal femoral epiphysis was performed to evaluate structural similarity. It was concluded that the 3D scaffolds presented a chemical composition and a macro-/micro-/nano-structure very close to that of the examined natural cancellous bone (porosity, pore size and alternating lamellae with random orientation). The protocols for biological tests was approved by the Institutional Ethics Committee of the Catholic University of Murcia (Reference CE051904). Because of the above, it can be concluded that the 3D biphasic scaffolds developed in this Doctoral Thesis have a potential application in bone tissue engineering.