Método de aclaramiento óptco para visualización de fluorescencia de tejidos neuronal y vascular en LSFM y su comparación con LSCM y SIM

Abstract

Los tejidos nerviosos y vascular forman intrincados circuitos y redes cuya organización se hace difícil entender a partir de cortes en dos dimensiones. Extraer información detallada con una perspectiva global de una muestra u órgano intacto ha sido un desafío fundamental en biomedicina y biotecnología, ya que en su mayoría los tejidos biológicos son opacos, lo que dificulta la penetración de la luz, restringiendo el contraste y visualización de la estructura interna. La mayoría de las técnicas de corte histológico convencional proporcionan información bidimensional sobre las estructuras anatómicas y los componentes celulares dentro de las muestras de tejidos, sin embargo, estos son prácticamente tridimensionales, por lo que se hace necesario visualizar su forma tridimensional. Con el objetivo de optimizar un método de aclaramiento óptico para visualización de tejidos neuronal y vascular inmunomarcados en su forma tridimensional en Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), se probaron varios protocolos de aclaramiento hidrofóbicos e hidrofílicos para obtener una transparencia de cerebros y ojos de ratones C57BL/6 y ratas Long-Evans (Métodos CLARITY, 3DISCO y Etanol-ECi), así como muestras enteras de retinas no aclaradas. Con modificaciones del método Etanol-ECi se logró obtener una alta eficacia de aclaramiento, a partir de la cual se pudieron adquirir imágenes en LSFM y contrastarlas con imágenes de muestras adquiridas con Laser-Scanning Confocal Microscopy (LCFM) y Structured Illumination Microscopy (SIM). Estas modificaciones suponen un avance en el campo de la microscopía, especialmente para el estudio de procesos relacionados con la neovascularización o la degeneración neuronal.

The nervous and vascular tissues form intricate circuits and networks whose organization is difficult to understand from two-dimensional cuts. Extracting detailed information with a global perspective of an intact sample or organ has been a fundamental challenge in biomedicine and biotechnology, since most biological tissues are opaque, which makes it difficult for light to penetrate, restricting contrast and visualization of the internal structure. Most conventional histological cutting techniques provide two-dimensional information on the anatomical structures and cellular components within the tissue samples; however, these structures are practically three-dimensional. In order to optimize an optical clearance method for visualization of immunolabelled neuronal and vascular tissues in their three-dimensional form in Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), various hydrophobic and hydrophilic clearance protocols were tested to obtain transparency of brains and eyes of C57BL / 6 mice and Long-Evans rats (CLARITY, 3DISCO and Ethanol-ECi methods), as well as whole unclear retinal samples. With modifications of the Ethanol-ECi method, it was possible to obtain a high clearance efficiency, from which images were acquired in LSFM and compared with images of samples acquired with Laser-Scanning Confocal Microscopy (LCFM) and Structured Illumination Microscopy (SIM). These modifications represent an advancement in the field of microscopy, especially for the study of processes related to neovascularization or neuronal degeneration.