La proteína antifúngica PeAfpA: optimización de su producción biotecnológica y aplicación en patosistemas postcosecha

Abstract

La proteína antifúngica PeAfpA de Penicillium expansum presenta gran interés agroalimentario debido a su elevada estabilidad y potente actividad antifúngica frente a un amplio rango de hongos fitopatógenos. En este trabajo se han evaluado distintas estrategias biotecnológicas con las que optimizar la producción de PeAfpA en Penicillium chrysogenum. Por un lado, la expresión heteróloga del gen de PeAfpA bajo el control de su propio promotor afpa ha permitido la correcta secreción y procesado de la proteína en P. chrysogenum. La comparación de la cinética de producción a 3, 5, 7 y 10 días respecto a la cepa silvestre P. expansum CMP-1 resalta la existencia de un patrón de producción diferencial, que a tiempos cortos es ligeramente superior en la cepa de P. chrysogenum. Además, la purificación de PeAfpA mediante cromatografía de intercambio catiónico ha permitido identificar la secreción simultánea de las proteínas PAFB y PAFC en los sobrenadantes líquidos de la cepa sobreproductora. Por otro lado, se ha evaluado la generación de versiones quiméricas de PeAfpA con las que incrementar su rendimiento de producción y actividad antifúngica, para lo que se diseñó una versión dimérica y dos versiones quiméricas basadas en su combinación con la proteína Sca de Penicillium digitatum. Sin embargo, ninguno de los transformantes de P. chrysogenum fueron capaces de sintetizar las proteínas diseñadas biotecnológicamente. Finalmente, se ha abordado la optimización de las condiciones de inoculación para la ejecución de ensayos de infección in vivo con los que evaluar el efecto protector de PeAfpA frente a la infección de P. digitatum y P. italicum en limones.

The antifungal protein PeAfpA from Penicillium expansum shows great agri-food interest due to its high stability and potent antifungal activity towards a wide range of phytopathogenic fungi. In this work several biotechnological strategies have been applied in order to optimize PeAfpA production in Penicillium chrysogenum. Heterologous expression of PeAfpA under the control of its own promoter afpa led to the correct secretion and processing of the protein in P. chrysogenum. Likewise, monitoring of PeAfpA production after 3, 5, 7 and 10 days of incubation in comparison to the natural producer P. expansum CMP-1 showed a different pattern of production with a slightly higher yield in P. chrysogenum at short times. Furthermore, PeAfpA purification by cationic exchange chromatography enabled the identification of both PAFB and PAFC antifungal proteins in the supernatant of the PeAfpA-overproducing P. chrysogenum strain. Alternatively, quimeric protein production has been evaluated as a strategy to improve PeAfpA yield and antifungal activity. A dimeric protein and two quimeric combinations based on the fusion with the Sca anionic protein from Penicillium digitatum were designed for their bioproduction in P. chrysogenum. Nevertheless, none of the transformants were able to synthetize the designed proteins. Finally, optimization of the inoculation conditions for in vivo protective assays were carried out in order to evaluate the effect of PeAfpA against P. digitatum and P. italicum infection in lemon fruits.