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El gen MAS2 de Arabidopsis es esencial,codifica una proteína ortóloga de las NKAP animales y participa en el silenciamiento del ADN ribosómico 45S


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Title:
El gen MAS2 de Arabidopsis es esencial,codifica una proteína ortóloga de las NKAP animales y participa en el silenciamiento del ADN ribosómico 45S
Authors:
Sánchez García, Ana Belén
Tutor:
Ponce Molet, María Rosa
Department:
Departamentos de la UMH::Biología Aplicada
Issue Date:
2016-09-09
URI:
http://hdl.handle.net/11000/5136
Abstract:
Una parte importante de la regulación de la expresión de muchos genes eucarióticos es postranscripcional. Participan en este proceso en Arabidopsis los complejos del silenciamiento génico inducido por ARN (RISC), cuyo componente principal es la proteína AGO1 (ARGONAUTE1). La insuficiencia de función del gen AGO1 perturba numerosos procesos de desarrollo y suele causar esterilidad o letalidad. Para comprender mejor la actividad y las interacciones de AGO1, se realizó en el laboratorio de María Rosa Ponce una búsqueda de modificadores del fenotipo morfológico de su alelo ago1-52, que es hipomorfo, viable y fértil. Se aislaron así 23 mutantes inducidos por metanosulfonato de etilo, de fenotipo similar al silvestre, y se denominó MAS (MORPHOLOGY OF AGO1-52 SUPPRESSED) a sus genes supresores. La clonación posicional de uno de ellos, MAS2, reveló que codifica una proteína homóloga de las NKAP (NF-kappa B Activating Protein) de los metazoos. MAS2 es un gen de copia única y esencial: sus alelos insercionales mas2-2 y mas2-3 son recesivos y letales embrionarios. Hemos identificado 9 alelos portadores de mutaciones puntuales supresoras, 8 de las cuales (mas2-1 y de mas2-4 a mas2-10) se agrupan en la región que codifica el dominio conservado SynMuv, que caracteriza a las NKAP. mas2-1 suprime el fenotipo de ago1-51 y ago1-52, cuyo splicing está alterado, pero no el de ago1-25 y ago1-27, que causan sustituciones de aminoácidos. Tanto la sobreexpresión constitutiva del alelo silvestre MAS2 como la del mutante mas2-1 carecen de efecto fenotípico en la estirpe silvestre; la sobreexpresión de mas2-1, pero no la de MAS2, suprime el fenotipo de ago1-52. Estos resultados sugieren que mas2-1 es un alelo antimorfo del gen MAS2. El mutante ago1-52 produce dos variantes del ARN mensajero (ARNm) de AGO1, una mutante y mayoritaria y otra silvestre y casi indetectable. La proporción relativa de la variante de ARNm silvestre se incrementa en casi todos los dobles mutantes ago1-52 mas2 estudiados. Estos resultados indican que los alelos mas2 portadores de mutaciones puntuales son supresores informacionales y que la proteína MAS2 participa en el procesamiento del ARN en general o el de AGO1 en particular. Hemos construido un microARN artificial que reprime parcialmente a MAS2 (amiRMAS2) y causa floración temprana, deforma las hojas y las flores y reduce la fertilidad. La proporción relativa de la proteína AGO1 silvestre es mucho mayor en los dobles mutantes ago1-52 mas2 que en el mutante simple ago1-52. En las plantas ago1-52 amiR-MAS2, por el contrario, los niveles de la proteína AGO1 silvestre se reducen. Nuestros resultados sugieren que MAS2 participa en algún mecanismo de control de la calidad de los ARNm, favoreciendo la traducción de la variante silvestre o dificultando la de la mutante. Hemos obtenido una fusión transcripcional MAS2pro:GUS, con la que hemos visualizado la expresión de MAS2 en todos los tejidos estudiados, que alcanza valores máximos en células en división activa, como las de los ápices de la raíz y de las hojas vegetativas. También hemos obtenido los transgenes 35Spro:MAS2:GFP y MASpro:MAS2:GFP, que nos han permitido establecer que MAS2 es una proteína nuclear en células en división muy activa, y perinucleolar en las restantes. Hemos demostrado mediante hibridación in situ fluorescente que MAS2 se acumula en el ADN ribosómico (ADNr) 45S de los organizadores nucleolares. El gen NUC-L1 de Arabidopsis codifica la NUCLEOLINA1, que participa en el control epigenético de la expresión del ADNr 45S. Tanto mas2-1 como amiR-MAS2 interaccionan genéticamente con un alelo nulo de NUC-L1. Hemos comprobado que los promotores del ADNr 45S están hipometilados en las plantas amiR-MAS2, una observación que indica que MAS2 regula negativamente al ADNr 45S. Hemos realizado una búsqueda de interactores basada en el ensayo del doble híbrido de la levadura, identificando proteínas presuntamente implicadas en el control del splicing, en la biogénesis del ribosoma y en la reparación de roturas dobles en el ADN. Estos interactores de MAS2 son similares a los descritos para la NKAP humana. Las proteínas SR deben su nombre a su dominio RS, que es rico en serina (S) y arginina (R); su participación en el splicing está sobradamente demostrada en diferentes especies de hongos, animales y plantas. La NKAP humana presenta una región aminoterminal a la que se ha considerado un dominio RS no canónico y se ha encontrado asociada a diferentes complejos del spliceosoma. Nuestros resultados indican que MAS2, la ortóloga en Arabidopsis de la NKAP humana, es una proteína multifuncional que participa en el control del splicing, en la traducción del ARNm y en la regulación transcripcional y el procesamiento de los genes del ADNr 45S. La letalidad embrionaria asociada a la insuficiencia de función de MAS2, su localización subcelular, la naturaleza de sus interactores y los procesos en los que participa revelan una conservación no solo estructural sino también funcional respecto a la NKAP humana.
Keywords/Subjects:
Genética
Molecular
Plantas
Knowledge area:
CDU: Ciencias puras y naturales: Biología: Genética general. Citogenética general. Inmunogenética. Evolución. Filogenia
Type of document:
application/pdf
Access rights:
info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:
Tesis doctorales - Ciencias e Ingenierías



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