Descubrimiento y caracterización de la actividad antiviral inducida por las moléculas tipo CRP de pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La proteína C-reactiva (CRP) es una pentraxina corta cuyos niveles séricos en mamíferos aumentan en presencia de estímulos desencadenantes de la respuesta de fase aguda y, por tanto, es ampliamente utilizada en clínica como biomarcador de inflamación. Clásicamente, la CRP ha sido descrita como una molécula de reconocimiento de patrones bacterianos y de células dañadas que actúa como primera línea de defensa del huésped. El presente trabajo aporta evidencias sobre una nueva función de esta molécula que se añade a su ya extensa lista de actividades descritas. En esta tesis se ha demostrado, in vitro e in vivo, la actividad protectora de las CRPs de pez cebra (zfCRP1-7) frente al virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV). Asimismo, se ha descubierto que existe una alta afinidad de las zfCRPs por los colesteroles, mostrando una unión preferencial por el 25-hidroxicolesterol (25-HOC), un lípido cuya actividad anti-SVCV ha sido descrita previamente y que muestra efectos sumatorios con la protección ofrecida por las zfCRPs. La exploración de los posibles mecanismos responsables de la protección antiviral conferida por las zfCRPs descartó la interferencia de estas moléculas con el proceso de entrada (unión al receptor y fusión) del virus, sugiriendo la regulación de algún mecanismo antiviral en la célula. También se ha descartado que esta actividad antiviral sea mediada por el sistema de interferón, el cual incluso se reprime tras el tratamiento de las células con zfCRPs. De acuerdo con nuestros resultados, las zfCRPs bloquean la autofagia o la vía endocítica del virus, dos procesos que convergen en el ciclo de replicación de otros virus. Por tanto, en este estudio se propone que la inhibición de la infectividad de SVCV se produce como consecuencia del bloqueo de la fusión de los endosomas/autofagosomas que contienen SVCV con el lisosoma. Este bloqueo evita la acidificación requerida para la actividad fusogénica de la proteína G vírica y, por tanto, impide la liberación del virus al citoplasma y su replicación. Este efecto también se observó tras el tratamiento de las células con 25-HOC o metil-􀎆-ciclodextrina (secuestrador de colesterol) previo a la infección con SVCV, sugiriendo la alteración de los niveles de colesterol celulares como causa de la actividad antiviral. La desregulación de estos niveles parece estimular la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que llevaría a la inhibición de la fusión autofagosoma-lisosoma.

C-reactive protein (CRP) is a short pentraxin whose serum levels in mammals increase in the presence of stimuli that trigger the acute phase response and, therefore, it is widely used in clinic as an inflammation biomarker. CRP has been classically described as a molecule of recognition of bacterial patterns and damaged cells that acts as the first line of defence of the host. The present work provides evidence of a novel function of this molecule expanding its already wide range of biological activities. Our work demonstrates in vitro and in vivo the protective activity of zebrafish’s Creactive proteins (zfCRPs) on the infection of the spring viremia of carp virus (SVCV). Likewise, a high affinity of zfCRPs for cholesterols was found, showing a preferential binding by 25-hydroxycholesterol (25-HOC), a lipid whose anti-SVCV activity has been previously described, showing additive antiviral effects over the protection confered by the zfCRPs. The exploration of the possible mechanisms responsible for the zfCRPs antiviral activity ruled out the interference of these molecules with the process of viral entry (binding and fusion), suggesting the regulation of some antiviral mechanism in the cell. We could not find a relationship of the CRP antiviral activity with the stimulation of interferon system, which appears to be repressed after the treatment of the cells with zfCRPs. According to our results, zfCRPs block autophagy or the endocytic pathway of the virus, two processes that converge in the replication cycle of other viruses. Therefore, this study proposed that the inhibition of SVCV infectivity is consequence of blocking the fusion of the endosomes/autophagosomes containing SVCV with the lysosome. This blocking prevents the acidification required for the fusogenic activity of the viral G protein and, consequently prevents the release of the virus to the cytoplasm and its replication. This effect was also observed after treatment of the cells with 25-HOC or methyl-􀎆-cyclodextrin (a cholesterol depleting agent) prior to infection with SVCV, suggesting the involvement of cellular cholesterol levels in antiviral activity. Deregulation of membrane cholesterol seems to stimulate the production of reactive oxygen species, which has an inhibitory effect of the autophagosome-lysosome fusion.