Genetic alterations in cortical development as a cause of epileptogenic disorders

Abstract

During embryogenesis, the developing cerebral cortex undergoes a dramatic expansion and folding. Alterations in cortical folding cause intellectual impairment and epileptogenic disorders, demonstrating its significant functional relevance. Some of the most common pathologies are polymicrogyria, the formation of multiple small folds; and periventricular nodular heterotopia (PVNH), where neurons accumulate ectopically in the vicinity of the telencephalic ventricles forming nodules, which act as epileptic foci. Mutations in PIK3R2 and FLNA are found causative for these pathologies, respectively. A novel gain-of-function mutation was identified in PIK3R2, a gene coding for a regulatory subunit in the (PI3K)-AKT-mTOR pathway, causing bilateral polymicrogyria in patients. To understand the cellular mechanisms underlying this pathology, we performed functional experiments in developing mice and ferrets by overexpressing PIK3R2 with a mutation found in patients, or its wild-type counterpart. We found that overexpression of PIK3R2 in mouse embryos by in utero electroporation caused an increase in proliferation of Radial Glia (RGCs) and Intermediate Progenitor Cells (IPCs), leading to their greater selfamplification. Migration of cortical neurons was also impaired, resulting in their accumulation of cells in deep cortical layers at embryonic and postnatal stages. Similarly, in ferret visual cortex the overexpression of Pik3r2 causes a delay in neuronal migration, a defect observable in longterm experiments in which juvenile animals showed an increase in cells populating cortical layers V and VI with respect to controls. In contrast, when the manipulation was performed in the parietal cortex, we detect a greater neurogenesis and an ectopic positioning of neurons at embryonic stages, which was consolidated in juvenile ferrets, presenting neuronal periventricular heterotopias and an overmigration defect altering cortical surface. Our findings demonstrate that increased levels of PIK3R2 alters progenitor cell proliferation and neuronal migration during cortical development in an area-specific manner, which suggests a different robustness of cortical areas. Periventricular nodular heterotopia (PVNH) has been associated to mutations in the FLNA gene.Here, we analyzed the expression pattern of FlnA in cortical development of mouse and ferret, and we observed the highest levels of expression in germinal layers in both animal models. Importantly, FlnA expression in ferret was heterogeneous along the Outer Subventricular Zone (OSVZ), being higher in the prospective gyri compared to sulci. Next, we performed overexpression and knock down experiments by in utero electroporation of full length FlnA and FlnA-shRNA, respectively, in mouse embryos. Overexpression of FlnA causes a delay in neuronal migration at embryonic stages. Additionally, this retention is maintained postnatally (P21), when we can find accumulation of neurons resembling periventricular nodules. Upon FlnA knock down, we find that those neurons that finally migrate fail to acquire their proper laminar position, ending misplaced in superficial positions. An alteration in neuronal migration was observed also in postnatal ferrets electroporated with FlnA knock down, but not in overexpression conditions. However, overexpression of FlnA causes a disruption of the apical lamina resulting in premature cell delamination or death, although this do not cause the formation of periventricular nodules. Finally, we analyzed the expression pattern of a gene involved in subcortical band heterotopia, Eml1, during ferret cortical development. We observed that it is expressed in germinal layers and in the cortical plate, but in contrast to the other gene that we have analyzed, the highest expression in the germinal layers starts later in development, contrary to what has been previously observed in mouse. Overexpression experiments performed in ferret visual cortex showed a slight neuronal migration defect at early postnatal stages that was selfcorrected later during development.

Durante la embriogénsis, el desarrollo de la corteza cerebral sufre una dramática expansión y plegamiento. Alteraciones en el plegamiento cortical causan discapacidad intelectual y desórdenes epilépticos, demostrando su importancia funcional. Algunas de las patologías más comunes son polimicrogiria, la formación de múltiples pequeños giros; y heterotopia nodular periventricular, en la que las neuronas se acumulan ectópicamente en la vicinidad de los ventrículos telencefálicos formando nódulos que actúan como foco epiléptico. Mutaciones en PIK3R2 y FLNA se han definido causantes de estas patologías, respectivamente. Una nueva mutación de ganancia de función ha sido identificada en PIK3R2, un gen codificante para la subunidad reguladora de la cascada PI3-AKT-mTOR, causando polimicrogiria bilateral en pacientes. Para entender los mecanismos celulares que subyacen en esta patología, realizamos experimentos en ratones y hurones en desarrollo sobreexpresando PIK3R2 con la mutación hallada en pacientes, o su forma “salvaje”. Hemos visto que la sobreexpresión de PIK3R2 en embriones de ratón mediante electroporación in utero causa un incremento en proliferación de células de glia radial (RGCs) y células progenitoras intermedias (IPCs), dando lugar a una mayor auto-amplificación. La migración de las neuronas corticales también está afectada, resultando en una acumulación de células en las capas corticales profundas en estadios embrionarios y postnatales. De forma similar, la sobreexpresión de PIK3R2 en la corteza visual del hurón causa un retraso en la migración neuronal, un defecto observable en experimentos de largo tiempo de supervivencia en los que animales juveniles muestran un incremento en las células poblando las capas corticales V y VI respecto a los controles. En cambio, cuando la manipulación se realizó en la corteza parietal detectamos una mayor neurogénesis y una posición ectópica de las neuronas en estadios embrionarios, algo consolidado en hurones juveniles, presentando heterotopias periventriculares de neuronas y una sobremigración que altera la superficie cortical. Nuestros resultados desmuestran que el incremento de los niveles de PIK3R2 altera la proliferación de progenitores corticales y la migración neuronal durante el desarrollo cortical de forma área-específica, lo que sugiere una diferente robustez de las áreas corticales. La heterotopia nodular periventricular (PVNH) se ha asociado a mutaciones en el gen de FLNA. Aquí, analizamos el patrón de expresión de FlnA durante el desarrollo cortical de ratón y hurón, y observamos mayores niveles de expresión en las capas germinales de ambos modelos animales. Lo que es más importante, la expresión de FlnA en hurón es heterogénea a lo largo de la zona subventricular externa (OSVZ), siendo mayor en el giro prospectivo que en el surco. A continuación, realizamos experimentos de sobreexpresión y reducción de expresión mediante electroporación in útero de FlnA y FlnA-shRNA, respectivamente, en embriones de ratón. La sobreexpresión de FlnA causa un retraso en la migración neuronal a estadios embrionarios. Adicionalmente, esta retención se mantiene postnatalmente (P21), donde encontramos una acumulación de neuronas que logran parecerse a nódulos periventriculares. Respecto a reducción de expresión de FlnA, encontramos que esas neuronas que escapan de la ectopia en la materia blanca fallan en adquirir su posición laminar correcta, acabando inapropiadamente localizadas en posiciones superficiales. Una alteración en la migración neuronal también es observable en hurones postnatales electroporados para la pérdida de función, pero no en condiciones de ganancia de función. Sin embargo, la sobreexpresión de FlnA causa disrupción de la lámina apical, lo que resulta en una prematura delaminación celular o muerte, aunque esto no causa la formación de nódulos periventriculares. Finalmente, analizamos el patrón de expresión de un gen involucrado en la formación de bandas heterotópicas subcorticales, Eml1, durante el desarrollo corticald el hurón. Observamos que está expresado en las capas germinales y en la placa cortical, pero, adiferencia de los otros genes, la mayor expresión en las capas germinales empieza a estadios tardios del desarrollo, contrariamente a lo que se ha observado anteriormente en ratón. Experimentos de ganancia de función en la corteza visual del ratón muestran un leve defecto de migración neuronal en tempranos estadios postnatales que es corregido más tarde durante el desarrollo.