Secretases as potential biomarkers and therapeutic target for Alzheimer’s disease

Abstract

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive loss of memory and cognition. The brain of AD patients is characterized by co-existence of amyloid plaques, extracellular protein deposits where the major component is the β-amyloid peptide (Aβ), and neurofibrillary tangles (NFTs), composed of paired helical filaments of the microtubule-associated protein tau abnormally hyperphosphorylated (P-tau). The Aβ peptide is a small polypeptide generated by the proteolytic processing of a much larger transmembrane protein, the β-amyloid precursor protein (APP) through the successive action of two proteolytic enzymes, β-secretase and γ-secretase. γ-Secretase is an intramembranous multi-protein complex that cleaves more than 90 substrates, some of them with critical roles in neuronal function. Presenilin-1 (PS1) is the catalytic component of the γ-secretase complex. Our group has previously demonstrated the presence of PS1 in human cerebrospinal fluid (CSF) samples. Since the diagnosis for AD is mainly based on clinical symptoms, definition of an early biomarker for the disease is needed. Our present study further explores the potential of the levels of PS1 in human CSF as an early biomarker for AD. In this regard, we have analysed by Western blotting and sucrose gradients ultracentrifugation the levels of PS1 in CSF samples from symptomatic and asymptomatic genetically determined AD subjects (autosomal dominant AD: ADAD), from demented and non-demented Down Syndrome (DS) patients, from sporadic AD (sAD) and from mild cognitive impairment subjects (MCI), all compared to age-matched controls. We demonstrated an increase in high stable PS1 complexes and altered levels of CSF-PS1 in both symptomatic and asymptomatic ADAD subjects, in DS subjects with and without dementia and also in sAD and MCI subjects. We concluded that the occurrence of increased levels of high stable PS1 complexes in the CSF are more related to the brain pathological status than the occurrence of dementia and cognitive decline. Our results suggest that such increase is an early phenomenon associated to AD and may constitute an early and asymptomatic biomarker. Moreover, APP can undergo alternative processing pathways. Indeed, in the main pathway, the non-amyloidogenic pathway, APP is cleaved by α-secretase within the Aβ domain, precluding Aβ formation. We were also interested in characterize whether α- secretase ADAM10 (α-disintegrin and metalloprotease 10) is present in CSF. We found different ADAM10 species in human CSF. We identify by Western blotting two mature forms corresponding to the full length (ADAM10f) and the soluble form of ADAM10 (sADAM10), and also the immature form of the ADAM10 (proADAM10). In CSF samples from AD patients we found a significant decrease in mature forms, ADAM10f and sADAM10 compared to control CSF, while proADAM10 levels remained unaltered. Our data suggest the potential to explore decreased levels of mature forms of CSF-ADAM10 as a new and alternative biomarker for AD.Finally, we also extended our research on understanding the failure of γ-secretase inhibitors (GSI) as a therapy for AD. Most of the recently assayed AD therapies have not been successful to improve the condition of the patients. Some of these therapies aim to decrease the production of Aβ by inhibition of γ-secretase/PS1. Specifically, we addressed the possibility that GSIs can provoke a rebound effect, elevating the levels of the catalytic γ-secretase subunit, PS1. We performed in vitro experiments in which we obtained augments in PS1 after treatment with DAPT, a well-known GSI, or avagacestat, one of the first GSI that undergone clinical trials. We also performed in vivo experiments in which rats were sub-chronically treated with avagacestat. PS1 was increased in brain extracts from treated rats. In all the conditions, we found a rebound effect in PS1 as consequence of the γ-secretase inhibition. These results indicate that the rebound increase in PS1 in response to GSIs must be taken into consideration for the design of future therapeutic drugs.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria y capacidades cognitivas. El cerebro de los pacientes con EA se caracteriza por la presencia de depósitos extracelulares, las denominadas placas amiloides, cuyo principal componente es el péptido β-amiloide (Aβ), y ovillos neurofibrilares, formaciones intracelulares compuestas por filamentos de la proteína citoesquelética tau, anormalmente hiperfosforilizada (P-tau). El péptido Aβ es un pequeño polipéptido que se genera como resultado del procesamiento proteolítico de una proteína transmembrana de mayor tamaño, la proteína precursora del β amiloide (APP, del inglés amyloid precursor protein), a través de la acción sucesiva de dos enzimas proteolíticas, β-secretasa y γ-secretasa. γ-Secretasa es un complejo enzimático localizado en la membrana que procesa más de 90 sustratos diferentes, muchos de ellos con funciones importantes en la actividad neuronal. Presenilina-1 (PS1) es el componente catalítico de dicho complejo. Estudios previos de nuestro grupo han demostrado la presencia de PS1 en líquido cefalorraquídeo (LCR) humano. Actualmente, el diagnóstico de la EA está basado en la sintomatología clínica, por ello, existe una necesidad de definir un biomarcador temprano para la enfermedad. Uno de los estudios incluidos en la presente Memoria de Tesis explora el potencial de los niveles de PS1 en LCR humano como un biomarcador temprano para la EA. En esta línea de la investigación hemos analizado mediante Western blot y ultracentrifugación en gradientes de sacarosa los niveles de PS1 en muestras de LCR de sujetos sintomáticos y asintomáticos que presentan la variante genéticamente determinada de la EA (EA dominante autosómica), de individuos demenciados y no demenciados con síndrome de Down (SD), de pacientes con EA esporádica y de pacientes con déficit cognitivo leve (DCL), todos ellos comparados con controles de edad pareada. Con estos estudios hemos demostrado un incremento en los denominados complejos de PS1 altamente estables, así como niveles alterados de la PS1 en LCR de pacientes con EA dominante autosómica sintomáticos y asintomáticos, en pacientes con SD con y sin demencia y en los pacientes de EA esporádica y DCL. Concluimos que el incremento en el LCR de los niveles de complejos altamente estables de PS1 está más relacionada con el estado patológico del cerebro que con la progresión de la demencia y el declive cognitivo. Nuestros resultados sugieren que dicho aumento es un fenómeno temprano asociado con la EA y podría constituir un biomarcador asintomático temprano. Dentro de la línea de búsqueda de nuevos biomarcadores de EA incluimos un segundo estudio en el que analizamos ADAM10, proteína identificada como la responsable de la actividad α-secretasa en LCR. APP es procesada por dos vías alternativas, la no amiloidogénica, que es la vía principal en situaciones normales, y la vía amiloidogénica, en la que se genera el Aβ. En la vía no amiloidogénica, la enzima α- secretasa corta a APP por el dominio Aβ, evitando así la formación del péptido Aβ. Demostramos mediante Western blot que en LCR están presentes diferentes variantes de ADAM10 que corresponden a una forma inmadura que mantiene el prodominio, una forma madura completa no procesada y una forma truncada secretada desde la membrana celular. No obstante, lo más relevante es que encontramos que los niveles de formas maduras estaban disminuidos en LCR de pacientes con EA, en comparación con pacientes control. Sin embargo, la cantidad de forma inmadura era semejante entre muestras control y patológicas. Nuestros resultados sugieren los niveles reducidos de las formas maduras de ADAM10 en el LCR como un potencial y alternativo biomarcador para la EA. Por otro lado, también decidimos estudiar a que es debido el fracaso de los inhibidores de γ-secretasa (GSIs, del inglés gamma secretase inhibitors) como terapia para la EA. Hasta ahora, la mayoría de las terapias testadas para la enfermedad que han llegado a ensayo clínico no han tenido éxito alguno en la mejora cognitiva de los pacientes y los ensayos han tenido que ser suspendidos. Muchas de estas terapias son inhibidores de γ-secretasa o PS1 que tienen como fin reducir la producción de Aβ. Específicamente, en nuestro estudio abordamos la posibilidad de que el uso sostenido de GSIs pueda provocar un efecto rebote, elevando así los niveles de PS1, que contribuirían a un empeoramiento de la patología. Llevamos a cabo experimentos in vitro en los que realizamos tratamientos con dos GSIs, DAPT y avagacestat, este último probado en ensayos clínicos, y obtuvimos en ambos casos un aumento en PS1. Esto nos llevó a estudiar el efecto de avagacestat en experimentos in vivo en los cuales se realizó un tratamiento sub-crónico con el GSI avagacestat en ratas. Obtuvimos un incremento de los niveles de PS1 en los extractos de cerebro de las ratas tratadas con el inhibidor. En resumen, encontramos un efecto rebote en PS1 como consecuencia de la inhibición de γ- secretasa. Es por ello que estos resultados deben tenerse en cuenta para el diseño de futuros fármacos para la EA.

La malaltia d'Alzheimer (MA) és un desordre neurodegeneratiu caracteritzat per la pèrdua progressiva de memòria i capacitats cognitives. El cervell dels pacients amb MA es caracteritza per la presència de dipòsits extracel·lulars, les denominades plaques amiloides, el principal component dels quals és el pèptid β amiloide (Aβ), i cabdells neurofibrilars, formacions intracel·lulars compostes per filaments de la proteïna citoesquelètica tau, anormalment hiperfosforilitzada (P-tau). El pèptid Aβ és un petit polipèptid que es genera com a resultat del processament proteolític d'una proteïna transmembrana de major grandària, la proteïna precursora del β amiloide (APP, de l'anglès amyloid precursor protein), a través de l'acció successiva de dos enzims proteolítiques, β-secretasa i γ-secretasa. γ-Secretasa és un complex situat en la membrana que processa més de 90 substrats diferents, molts d'ells amb funcions importants en la funció neuronal. Presenilina-1 (PS1) és el component catalític de dit complex. Estudis previs del nostre grup han demostrat la presència de PS1 en líquid cefaloraquidi (LCR) humà. Actualment, el diagnòstic de la MA està basat en la simptomatologia clínica, per això, existeix una necessitat de definir un biomarcador primerenc per a la malaltia. Un dels estudis inclosos en la present Memòria de Tesi explora el potencial dels nivells de PS1 en LCR humà com un biomarcador primerenc per a la MA. En aquesta línia de la recerca hem analitzat mitjançant Western blot i ultracentrifugació en gradients de sacarosa els nivells de PS1 en mostres de LCR de pacients simptomàtics i asimptomàtics que presenten la variant genèticament determinada de la MA (MA dominant autosòmica), de pacients demenciats i no demenciats amb síndrome de Down (SD), de pacients amb MA esporàdica i de pacients amb dèficit cognitiu lleu (DCL), tots ells comparats amb controls d’edat aparellada. Amb aquests estudis hem demostrat un increment en els denominats complexos de PS1 altament estables, així com nivells alterats de la PS1 en LCR de pacients amb MA dominant autosòmica simptomàtics i asimptomàtics, en pacients amb SD amb i sense demència i en els pacients de MA esporàdica i DCL. Concloem que l'increment en el LCR dels nivells de complexos altament estables de PS1 està més relacionada amb l'estat patològic del cervell que amb la progressió de la demència i el declivi cognitiu. Els nostres resultats suggereixen que aquest augment és un fenomen primerenc associat amb la MA i podria constituir un biomarcador asimptomàtic primerenc. Dins de la línia de cerca de nous biomarcadors de la MA incloem un segon estudi en el qual analitzem ADAM10, identificada com l'enzim responsable de l'activitat α- secretasa en LCR. APP és processada per dues vies alternatives, la no amiloidogènica, que és la via principal en situacions normals, i la via amiloidogènica, en la qual es genera l'Aβ. En la via no amiloidogènica, l'enzim α-secretasa talla a APP pel domini Aβ, evitant així la formació del pèptid Aβ. Vam demostrar mitjançant Western blot que en LCR estan presents diferents variants d'ADAM10 que corresponen a dues formes madures, identificades com la proteïna sencera i la seva forma soluble, així com una forma immadura. No obstant això, el més remarcable dels nostres resultats és que trobem que els nivells de formes madures estaven disminuïts en LCR de pacients amb MA, en comparació amb pacients control; mentre que la quantitat de forma immadura era semblant entre mostres control i patològiques. Els nostres resultats suggereixen els nivells reduïts de les formes madures d'ADAM10 en el LCR com un potencial i alternatiu biomarcador per a la MA. D'altra banda, també decidim estudiar el fet a que és degut el fracàs dels inhibidors de γ-secretasa (GSIs, de l'anglès gamma secretase inhibitors) com a teràpia per a la MA. Fins ara, la majoria de les teràpies testades per a la malaltia que han arribat a assaig clínic no han tingut èxit algun en la millora cognitiva dels pacients i els assajos han hagut de ser suspesos. Moltes d'aquestes teràpies són inhibidors de γ-secretasa o PS1 que tenen com a fi reduir la producció de Aβ. Específicament, en el nostre estudi abordem la possibilitat que l'ús sostingut de GSIs puga provocar un efecte rebot, elevant així els nivells de PS1, que contribuirien a un empitjorament de la patologia. Duem a terme experiments in vitro en els quals realitzem tractaments amb dos GSIs, DAPT i avagacestat, que ha estat provat en assajos clínics i vam obtenir en tots dos casos un augment en PS1. Això ens va portar a estudiar l'efecte de avagacestat en experiments in vivo, en els quals es va realitzar un tractament sub-crònic amb aquest compost en rates. Vam obtenir un increment dels nivells de PS1 en els extractes de cervell de les rates tractades amb l'inhibidor. En resum, trobem un efecte rebot en PS1 com a conseqüència de la inhibició de γ-secretasa. És per això que aquests resultats han de tenir-se en compte per al disseny de futurs fàrmacs per a la MA.