Funciones morfogenéticas de los genes ANU1, ANU4, ANU9, ANU12, SCA1, SCA5, ICU11 y CP2 de Arabidopsis

Abstract

En esta Tesis hemos sometido a análisis genético y molecular a varios mutantes foliares previamente aislados en el laboratorio de José Luis Micol, en el que habían sido asignados a las clases fenotípicas Angulata (Anu), Scabra (Sca) e Incurvata (Icu). Los mutantes anu presentan hojas de tamaño inferior al silvestre, parcialmente despigmentadas e indentadas. Las hojas de los mutantes sca son variegadas e indentadas y su haz y envés son irregulares. El limbo foliar de los mutantes icu se recurva hacia al haz. Hemos contribuido a la caracterización de los mutantes anu1-1, anu4, anu9-1, anu12, sca1, sca5 e icu11-1. La despigmentación parcial y la indentación de las hojas de los mutantes anu y sca nos condujo a considerarlos candidatos a padecer alguna disfunción del cloroplasto y potencialmente informativos sobre la relación entre la biogénesis de este orgánulo y el desarrollo foliar. La curvatura de las hojas de los mutantes icu indicó una alteración de la dorsoventralidad y sugirió su utilidad para el estudio del crecimiento de los tejidos dorsales (adaxiales) y ventrales (abaxiales) y/o su coordinación. Todos los mutantes mencionados habían sido sometidos previamente a análisis del ligamiento a marcadores moleculares, que delimitó intervalos de 30-750 kb, candidatos a contener los genes causantes del fenotipo a estudio. Hemos caracterizado las mutaciones de dichos intervalos mediante secuenciación masiva, estrategia que nos ha permitido identificar los genes ANU1, ANU4, ANU9, ANU12, SCA1 y SCA5. Hemos confirmado la identidad de estos genes mediante ensayos de alelismo y de complementación fenotípica mediada por transgenes portadores de los correspondientes alelos silvestres. ANU1 es At1g21650, al que autores anteriores denominaron SECRETIONA2 (SECA2), que codifica una proteína con actividad ATPasa localizada en el estroma de los cloroplastos; participa en el sistema Sec de importación de proteínas a los tilacoides. ANU4 es At1g02280, que codifica TRANSLOCON AT THE OUTER ENVELOPE MEMBRANE OF CHLOROPLASTS 33 (TOC33), uno de los componentes del sistema TOC de la envoltura de los cloroplastos, que importa proteínas del citoplasma. ANU9 es At5g14100, que codifica NON-INTRINSIC ABC PROTEIN 14 (NAP14), otro transportador de la envoltura del cloroplasto. ANU12 es At1g49970, que codifica la subunidad CASEINOLYTIC PROTEASE RING 1 (ClpR1) del complejo Clp de degradación de proteínas del cloroplasto. Hemos empleado los mutantes anu1, anu4, anu9 y anu12 para contrastar la validez de la secuenciación masiva para identificar genes causantes de fenotipos de interés. No hemos considerado conveniente continuar su estudio, dado que los correspondientes cuatro genes habían sido caracterizados en mayor o menor medida por autores anteriores. El ribosoma citoplásmico contribuye a la polaridad dorsoventral de las hojas de Arabidopsis. Son prueba de ello los alelos hipomorfos y nulos de varios genes que codifican proteínas ribosómicas, que incrementan la severidad de la ventralización causada por la insuficiencia de función de ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y AS2; el complejo represor AS1-AS2 es esencial para la especificación de la identidad de los tejidos dorsales de la hoja. Los dobles mutantes sca1 as2 manifiestan un fenotipo sinérgico. Hemos establecido que SCA1 es At2g33800, cuyo producto es RPS5, un componente de la subunidad menor del ribosoma del cloroplasto. Se demuestra así que el ribosoma del cloroplasto participa, como el citoplásmico, en la formación del patrón adaxial-abaxial. Por su parte, SCA5 es At5g20040, que codifica la TRNA ISOPENTENYL TRANSFERASE 9 (IPT9), que participa en la síntesis de la cis-zeatina, una citoquinina. Los mutantes foliares no solo son útiles para identificar genes específicamente implicados en la organogénesis de la hoja: también sirven para desentrañar los mecanismos de desarrollo que la hoja comparte con otros órganos de las plantas. Este ha sido el caso de icu11-1. En el laboratorio de J.L. Micol se concluyó antes del comienzo de esta Tesis que icu11-1 (a) interacciona con alelos mutantes de genes que codifican componentes de la maquinaria epigenética, como ICU1 (más conocido como CURLY LEAF; CLF) e ICU2, (b) causa la desrepresión ectópica y heterocrónica de genes de identidad floral en sus hojas, y (c) es un alelo de At1g22950, que codifica una presunta dioxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato y Fe2+ (2OGD). Hemos establecido que ICU11 pertenece a una familia de cinco genes de la superfamilia de las 2OGD, a la que hemos llamado CUPULIFORMIS (CP). ICU11 y CP2, su parálogo más próximo, son funcionalmente redundantes: los dobles mutantes icu11 cp2 carecen de desarrollo vegetativo y florecen inmediatamente después de la germinación. Este fenotipo letal es muy similar al de los alelos de insuficiencia de función de EMBRYONIC FLOWER 1 (EMF1) y EMF2, que codifican proteínas del grupo Polycomb con funciones epigenéticas conocidas. La secuenciación masiva del ARN de icu11-1 ha revelado la desregulación de cientos de genes, algunos de los cuales modulan el desarrollo floral, como los de la familia MADS-box. La desrepresión de uno de estos últimos, SEPALLATA3 (SEP3), causa la curvatura foliar de icu11-1. Hemos demostrado mediante secuenciación masiva del genoma de icu11-1 tras su tratamiento con bisulfito e inmunoprecipitación de su cromatina que ICU11 y CP2 participan en la modificación química de las histonas, pero no en la metilación del ADN. El resultado más importante de esta Tesis es la identificación de una familia de componentes de la maquinaria epigenética cuya actividad parece distinta de las previamente descritas.

We studied Arabidopsis leaf mutants previously isolated in the laboratory of José Luis Micol, where these mutants had already been assigned to the Angulata (Anu), Scabra (Sca) and Incurvata (Icu) phenotypic classes. The anu mutants are smaller than the wild type, with pale-green leaves of prominent marginal teeth. Leaves from the sca mutants show variegation, dentate margins and irregular lamina surfaces. The icu mutants exhibit curly leaves. Here, we contribute to the characterization of the anu1-1, anu4, anu9-1, anu12, sca1, sca5 and icu11-1 mutants. The marginal teeth and depigmentation shared by anu and sca leaves indicate defective photosynthesis and suggest that these mutants might be useful for the study of the relationship between chloroplast biogenesis and whole leaf organogenesis. Leaf hyponasty in the icu mutants indicates altered dorsoventrality and suggests their usefulness for the study of dorsal (adaxial) and ventral (abaxial) tissue growth, and/or their coordination. All the mutations studied in this work had already been mapped by linkage analysis to molecular markers, which delimited candidate intervals ranging from 30 to 750 kb. We studied the mutations within these intervals by massive sequencing. This strategy allowed us to identify the ANU1, ANU4, ANU9, ANU12, SCA1 and SCA5 genes. We confirmed the correct identification of these genes through allelism tests and complementation mediated by transgenes carrying the corresponding wild-type alleles. ANU1 was found to be At1g21650, already named SECRETIONA2 (SECA2) by previous authors, which encodes a protein with ATPase activity, localized at the stroma of the chloroplasts, and involved in the Sec system, which imports proteins to the thylakoids. ANU4 is At1g02280, which encodes the TRANSLOCON AT THE OUTER ENVELOPE MEMBRANE OF CHLOROPLASTS 33 (TOC33), one of the components of the TOC complex, which imports proteins from the cytoplasm. ANU9 is At5g14100, which encodes NON-INTRINSIC ABC PROTEIN 14 (NAP14), another transporter in the chloroplast envelope. ANU12 is At1g49970, which encodes CASEINOLYTIC PROTEASE RING1 (ClpR1), a component of the Clp complex for chloroplast protein degradation. We used the anu1, anu4, anu9 and anu12 mutants to test the validity of massive sequencing to identify causal genes for phenotypes of interest. Since these four genes have been characterized to different extents by previous authors, we decided not to continue their study. The cytoplasmic ribosome participates in the dorsoventral patterning of Arabidopsis leaves, as shown by the hypomorphic or null alleles of several genes encoding ribosomal proteins, which increase the severity of the ventralization caused by loss of function of ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) and AS2; the AS1-AS2 repressor complex is essential for dorsal identity specification in leaf tissues. The sca1 as2 double mutants exhibited a synergistic phenotype. We demonstrated that SCA1 is At2g33800, whose product is RPS5, a component of the small subunit of the chloroplast ribosome. This is an unexpected discovery, since it indicates that not only the cytoplasmic ribosome, but also the chloroplast ribosome, is involved in dorsoventral pattern formation. On the other hand, SCA5 is At5g20040, which encodes TRNA ISOPENTENYL TRANSFERASE 9 (IPT9), involved in the biosynthesis of cis-zeatin, a cytokinin. Leaf mutants are not only useful for identifying genes specifically involved in leaf organogenesis but may also provide information on the developmental mechanisms that leaves share with other plant organs. This has been the case for icu11-1. Previous analyses performed in the laboratory of J.L. Micol concluded that icu11-1 (a) genetically interacts with alleles of genes encoding components of the epigenetic machinery, such as ICU1 (also known as CURLY LEAF; CLF) and ICU2, (b) causes the ectopic and heterochronic derepression of flower organ identity genes in leaves, and (c) is an allele of At1g22950, which encodes a putative 2-oxoglutarate and Fe2+-dependent dioxygenase (2OGD). Here, we stablished that ICU11 belongs to a five-member gene family of the 2OGD superfamily, which we named CUPULIFORMIS (CP). ICU11 and its closest paralog CP2 are functionally redundant: the icu11 cp2 double mutants skip vegetative development and flower immediately after germination. This lethal phenotype is reminiscent to that caused by loss-of-function alleles of EMBRYONIC FLOWER 1 (EMF1) and EMF2, which encode Polycomb group proteins with known epigenetic functions. Massive sequencing of icu11-1 RNA revealed the deregulation of hundreds of genes, some of which regulate flower development, such as those of the MADS-box family. Derepression of one of these genes, SEPALLATA3 (SEP3), causes leaf hyponasty in icu11-1 plants. Massive bisulfite sequencing and chromatin immunoprecipitation of icu11-1 demonstrated that ICU11 and CP2 participate in histone chemical modification but not in DNA methylation. The most important result of this Thesis is the identification of a family of epigenetic machinery components whose activity seems different to those previously described.