Determinación de HLA-G en alergias y valoración de la microbiota intestinal en pacientes de edad pediátrica

Abstract

La alergia alimentaria o la hipersensibilidad alérgica a los alimentos se define como una serie de reacciones adversas causadas por mecanismos inmunológicos, mediados o no por la inmunoglobulina E (IgE), diferentes de la intolerancia alimentaria o respuesta alérgica de hipersensibilidad alimentaria causada por características fisiológicas específicas del huésped. Los procesos inflamatorios en la expresión de antígenos HLA-G se caracterizan por un polimorfismo alélico bajo, una distribución limitada del tejido y la presencia de isoformas ligadas a la membrana. La presencia de moléculas de HLA-G se ha asociado con funciones tolerogénicas en la respuesta celular innata y adaptativa, ya que los antígenos HLA-G son capaces de afectar la citotoxicidad de células NK y células T CD8+, CD4+ y maduración de células dendríticas. Por otra parte, el polimorfismo alélico del gen HLA-G (deleción/inserción del polimorfismo de una secuencia de 14 pb en el exón 8 en la región 3' no traducida) y el alelo nulo 01:05N, se ha asociado con la generación de un mRNA inestable y una proteína sHLA-G de producción más baja, sugiriendo una funcionalidad diferente para contrarrestar la inflamación presente en las enfermedades alérgicas alimentarias.

OBJETIVO

Determinar el polimorfismo inserción/deleción de 14 pb de HLA-G en el exón 8, el alelo nulo 01:05N, la concentración de la proteína HLA-G soluble en cuatro grupos de estudio y a su vez determinar la microbiota intestinal en pacientes con alergia No IgE mediada en edad pediátrica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron 157 muestras de saliva en 4 grupos de estudio: Controles Sanos, con alergia No IgE Mediada, IgE Mediada y grupo con otros procesos alérgicos. Se determinó el polimorfismo de deleción/inserción de 14 pb y el alelo nulo 01:05N. Como control positivo se utilizó el gen GAPDH y la línea celular JEG-3. La extracción de ADN se llevó a cabo con el Kit QIAamp Mini Kit de Qiagen. La cuantificación de muestras de ADN se realizó en el equipo NanoDrop, y para la PCR se emplearon oligonucleótidos específicos que amplificaron los productos de PCR con un tamaño molecular de 226 bp y 240 bp o ambos, dependiendo de la inserción ó la deleción de 14 pb en el exón 8 y de 223 bp para el alelo nulo. La valoración de la proteína se realizó con un ELISA empleando el Kit HLA-G ELISA de Exbio. El Western Blot se realizó con las muestras cuantificadas con el kit de medida de Proteínas BCA de Novagen. El gel de poliacrilamida usado fue al 10% de concentración de acrilamida/bisacrilamida. El anticuerpo primario de revelado de HLA-G fue el MEM-G/1 (1:500) de Exbio, y el anticuerpo secundario anti-IgG HRP anti-mouse (1:1000) de Merck Millipore. La secuenciación del DNA de las muestras fecales se realizó equipo Illumina MiSeq con configuración PE de 2x300. (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemania).

RESULTADOS

Se realizó la determinación de la deleción/inserción polimórfica de 14 bp del exón 8 en 157 muestras de pacientes con alergia alimentaria No IgE mediada (n=35), IgE mediada (n=20), otros procesos alérgicos (n=45) y controles sanos (n=57). En el grupo No IgE mediado se encontró el polimorfismo INS/DEL de 14 bp de HLA-G en comparación con los demás grupos de estudio en cuales predominó el polimorfismo INS/INS. Además de la determinación de un doble polimorfismo. Por otra parte, se llevó a cabo la detección de sHLA-G soluble en muestras de saliva por ELISA y de la proteína HLA-G por Western Blot en cada uno de los grupos de estudio. Las isoformas completas son una glicoproteína de 37 kDa. La detección de la proteína HLA-G se realizó en muestras representativas como controles positivos (línea celular JEG-3). En el grupo No IgE mediado, encontramos una disminución o ausencia de la proteína HLA-G y la concentración de ésta a nivel soluble en comparación con los demás grupos de estudio. Finalmente se realizó la evaluación de la microbiota intestinal en n=17 de pacientes con FPIES del grupo No IgE mediado, donde se determinaron varias especies pertenecientes a las Ruminococcaceae (F. prautsnitzii, R. champanellensis, I. butyric producens), Lactobacillaceae hominis), y Leuconostocaceae (W. confusa) que se encontraron en mayor proporción en los individuos control, mientras que especies como Eubacteriumhallii y Blautia spp, especies pertenecientes a la familia Lachnospiraceae, fueron más abundantes en pacientes con alergia alimentaria no mediada por IgE.

CONCLUSIONES

La deleción/inserción del polimorfismo de 14 bp en el exón 8 HLA-G y el alelo nulo 01:05N inducen la disminución de la expresión, y posiblemente la funcionalidad de la proteína soluble sHLA-G. La correlación entre la determinación a nivel genético del de HLA-G con la disminución en la detección de la proteína soluble sHLA-G se evidenció principalmente en el grupo de alergia No IgE mediado. El estudio de la microbiota intestinal y la concentración del sHLA-G en éste grupo de pacientes citados anteriormente nos permitió establecer el HLA-G como un posible biomarcador en la evolución de la enfermedad alérgica alimentaria.