Estudio de la conductividad eléctrica de la leche de oveja manchega como método de detección de mamitis

Abstract

El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es el estudio del uso de la conductividad eléctrica de la leche (CE) como método automático de detección de mamitis durante el ordeño mecánico de ovejas de raza Manchega. Para ello se han diseñado dos Ensayos con el fin de conseguir los siguientes objetivos específicos: 1. Estudiar el efecto de distintos factores no infecciosos (estado de lactación, número de parto, sesión de ordeño y fracción de ordeño) e infecciosos (estado sanitario de las glándula mamaria) en la lectura de la CE de la leche (Ensayo 1). 2. Estudiar el empleo de umbrales absolutos de CE para discriminar el estado sanitario de las glándulas mamarias (Ensayo 1). 3. Estudiar el efecto de la instauración de la infección intramamaria en la CE de la leche glandular y su evolución en el tiempo siguiente a la infección (Ensayo 2). 4. Evaluar la capacidad de detección de mamitis de diversos algoritmos basados en la medida diaria de la CE de la leche glandular utilizando un conductímetro de laboratorio y un prototipo diseñado para la lectura automática diaria de la CE de la leche a nivel de glándula mamaria durante el ordeño mecánico (Ensayo 2).

En el Ensayo 1 se realizaron dos Experimentos en los que se estudió el efecto de distintos factores no infecciosos e infecciosos en la lectura de la CE de la leche y el empleo de umbrales absolutos de CE para discriminar el estado sanitario de las glándulas mamarias (Objetivos 1 y 2). En el Experimento 1, se estudió el efecto del estado sanitario de las glándulas y de diversos factores no infecciosos (estado de lactación, sesión de ordeño: mañana o tarde y número de lactación) que afectan al empleo de la CE de la leche como método de detección de mamitis en ganado ovino lechero. Así mismo, también se estudió la relación de la CE con la composición de la leche (macrocomposición y contenido mineral) y la relación existente entre la CE y el recuento de células somáticas (RCS). Finalmente, se evaluó el uso de umbrales de CE como método de detección de mamitis. Para ello, se realizó un seguimiento de la CE de la leche glandular a lo largo de dos lactaciones consecutivas durante las que se controlaron 42 y 43 ovejas, respectivamente. Se realizaron 7 controles quincenales en los que se analizó la CE, el RCS, la composición y el contenido mineral de la leche glandular en el ordeño matutino y vespertino. Antes del ordeño de la mañana, se tomaron muestras asépticamente para

Resumen

realizar un análisis bacteriológico, cuyos resultados junto con el RCS se utilizaron para la clasificación de las glándulas de acuerdo a su estado sanitario (sanas, con infección latente o infectadas). El estado de lactación (mayores valores de CE al inicio y final de lactación que en la mitad de la lactación), el número de lactación (mayor CE en las multíparas que en las primiparas), la sesión de ordeño (mayor CE en la mañana que en la tarde), el estado sanitario (mayor CE en las glándulas con mamitis infecciosa que en las sanas y con mamitis latente) tuvieron un efecto significativo en la CE y en el RCS de la leche. La CE de las ovejas multíparas fue significativamente superior a la registrada en las ovejas primíparas; esta diferencia se observó en ambos ordeños, independientemente del estado de lactación o el estado sanitario de las glándulas. De forma general, la CE no se mantuvo constante en toda la lactación. El valor máximo de CE se registró en el primer control (a las dos semanas del parto), observándose un descenso significativo entre la segunda y cuarta semana de lactación. A partir de la cuarta semana, la CE descendió paulativamente hasta alcanzar el valor mínimo en la décima semana, aunque ya no se observaron diferencias significativas entre controles sucesivos. En las cuatro últimas semanas del experimento, la CE se incrementó, pero sin llegar a alcanzar los valores registrados al inicio de la lactación. La correlación de la CE con el RCS solo fue significativo al analizar todos los datos en conjunto (r = 0,33) y para RCS≥ 600.000 cel/mL (r = 0,25). Los cambios en el contenido graso de la leche, explican en gran medida la variación de la CE (R2parcial = 0,24). También se observó, que para un mismo umbral absoluto de CE, la especificidad (Sp) y la sensibilidad (Se) variaron en función del número de parto o de la sesión de ordeño. El punto en el que se registró la mejor combinación de Se y Sp fue al aplicar un umbral de 4,3 mS/cm en las ovejas primíparas (Se = 63,64% y Sp = 63,31%), pero al aplicar este mismo umbral de forma general, aunque se obtuvo una Sp ligeramente superior (64,67%) la Se disminuyó al 49,57%. En todos los casos se registró un bajo valor predictivo positivo (VPP). El valor máximo se registró en ovejas multíparas al aplicar un umbral de 5 mS/cm, pero con este umbral solo se obtuvo una Se = 18,96%. En cambio, el valor predictivo negativo (VPN) no fue en ningún momento inferior al 80%. En el Experimento 2, se estudió el efecto de la fracción de ordeño y el estado sanitario de las glándulas en la CE de la leche, así como la relación de la CE con la composición de la leche y la relación entre la CE y el RCS. Finalmente, al igual que en el

Resumen

Experimento 1, se evaluó el uso de umbrales absolutos de CE como método de detección de mamitis en las distintas fracciones de ordeño. Para ello, se realizó un único control en el que se analizó la CE, macro-composición de la leche y RCS de 178 glándulas de ovejas de raza Manchega en tres fracciones de ordeño: primeros 100 mL (F1); leche máquina (F2); leche de apurado (F3). Para la clasificación de las glándulas según su estado sanitario, se realizaron tres controles bacteriológicos (una semana antes, el día de toma de muestras y una semana después) en los que se recogieron muestras asépticamente antes del ordeño de la mañana para su posterior siembra y análisis bacteriológico. La fracción de ordeño, el estado sanitario de las glándulas y el número de parto de las ovejas tuvieron un efecto significativo en la CE y el RCS. La interacción del estado sanitario con la fracción de ordeño solo mostró un efecto significativo en el RCS. La CE registrada en F1 fue superior a la registrada en F2, y esta a su vez superior a la registrada en F3. Al clasificar las glándulas en función del estado sanitario, aunque se observó un descenso de la CE a medida que transcurría el ordeño, no se observaron diferencias significativas entre F2 y F3 en las glándulas mamíticas. La correlación de la CE con el RCS, aunque moderada, fue significativa en las tres fracciones de ordeño. Los cambios en el contenido en grasa y lactosa en la leche, explicaron en gran medida la variación de la CE (R2parcial = 0,45 y 0,30 respectivamente), observándose una relación negativa entre ambas variables y la CE de la leche. Para un mismo umbral de CE, la Sp y Se variaron ligeramente en función de la fracción de ordeño. El punto corte de ambas curvas, se dio para un umbral de 4,2, 4,1 y 4,0 mS/cm en la F1, F2 y F3 respectivamente, obteniendo en las tres fracciones valores de Se y Sp inferiores al 55%. El VPP se mantuvo en torno al 20% para umbrales inferiores a 4,4 mS/cm. Al incrementarse el umbral por encima de 4,4 mS/cm se mejoraba el VPP del método, pero se producía una pérdida de Se. El VPN se mantuvo por encima del 80% para todos los umbrales propuestos. En el Ensayo 2, se realizó un experimento con el fin de estudiar el efecto de la instauración de la infección intramamaria en la CE, el RCS y la producción de las glándulas y su evolución en el tiempo siguiente a la infección. También se evaluó la capacidad de detección de mamitis de diversos algoritmos basados en la medida diaria de la CE de la leche glandular utilizando un conductímetro de laboratorio y un prototipo diseñado para la lectura automática diaria de la CE de la leche a nivel de glándula mamaria durante el ordeño mecánico. Para ello se realizó un seguimiento diario en los dos ordeños

Resumen

(mañana y tarde) de la CE y de la producción de las glándulas de 26 ovejas libres de infección intramamaria durante 3,5 semanas. Tras este periodo, se simularon varias situaciones desfavorables para el estado sanitario de las glándulas mamarias (SDS) que pueden darse en explotaciones comerciales, evaluando el estado sanitario de las glándulas durante ese periodo. Las SDS se prolongaron hasta que se tuvo un número suficiente de glándulas infectadas, tras lo cual, el experimento se prolongó durante 3,5 semanas durante las que se realizó un seguimiento diario de la evolución de la CE y la producción y se continuaron realizando análisis bacteriológicos y midiendo el RCS. Las muestras de leche para determinar su composición se tomaron el día de inicio de las SDS y transcurridos 4, 7, 11, 18, 21 y 28 días de la instauración de la infección. Con los valores registrados de CE (con el conductímetro de laboratorio y con el prototipo) en ambos ordeños, se estudió el comportamiento de distintos algoritmos de cálculo basados en detectar desviaciones sobre el historial de la CE en ordeños consecutivos. El establecimiento de la infección intramamaria produjo un incremento del RCS y una disminución significativa de la producción, más acusada en ovejas infectadas bilateralmente que unilateralmente. La CE tras la instauración de la infección solo se elevó de forma significativa cuando la infección se produjo de forma bilateral. Con las medidas diarias de CE se aplicaron varios algoritmos basados en la detección de variaciones anómalas de la CE de la glándula individual y en variaciones de la RELCE (Relación de CE entre glándulas colaterales), observándose mejores resultados al utilizar las segundas. Los mejores resultados (Se = 91,7%; Sp = 90,9%; VPP = 91,7% y VPN = 90,9%) se obtuvieron al aplicar una regla basada en la detección de una desviación de la RELCE de tres veces la desviación típica con respecto a la media de RELCE de los registros tomados durante los 10 días anteriores (|RELCE - RELCEmed (10 días)| > 3 σ (10 días) ), al tener en cuenta el conjunto de los 5 días posteriores a la instauración de la infección. Con los datos registrados por el prototipo también se obtuvieron altas Se y Sp, pero los VPP y VPN fueron inferiores, atribuyéndose a la descalibración del equipo observada a lo largo del experimento. Por ello, se recomienda que en el desarrollo de equipos para la medida on- line de la CE se integren métodos de autocalibración. En este experimento, los cambios registrados en la CE se explicaron en gran medida por la variación del contenido en lactosa (R2parcial = 0,43). En cuanto a la correlación entre la CE y el RCS, fue significativa pero moderada en ambos ordeños, obteniéndose mayor

coeficiente de correlación cuando el RCS > 400.000 cel/mL y en el ordeño de la tarde respecto al ordeño de la mañana. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que la CE de la leche en ganado ovino Manchego está muy relacionada con la composición de la leche, por lo que puede ser utilizada como método de detección de mamitis siempre y cuando la infección llegue a provocar daños en la glándula mamaria capaces de alterar la composición de la leche. También hay otros factores no infecciosos que afectan a la CE de la leche: el estado de lactación, el número de lactación, el tipo de ordeño (mañana o tarde) o la fracción de ordeño, por lo que no es recomendable el uso de umbrales absolutos de CE para la detección de mamitis. El uso de algoritmos de cálculo basados en la comparación de la CE con medidas previas diarias de la CE de una misma glándula que permitan detectar variaciones anómalas de la variable ha obtenido resultados satisfactorios para la detección de mamitis. Para una correcta medida de la CE “on-line”, serían necesarios más estudios enfocados al diseño de sensores de menor tamaño que puedan de ser integrados en el tubo corto de leche o en la pezonera, dotados de un sistema de autocalibración, cuidando en todo momento que su fabricación sea a base de materiales autorizados para su uso en la industria agroalimentaria y que no se vean afectados por los detergentes utilizados en el lavado diario de las máquinas de ordeño.

The general aim of this doctoral thesis was to study the use of the electric conductivity of milk (EC) as an automatic method of detecting mastitis during machine milking of Manchega breed sheep. To this end, two assays were designed to achieve the following specific objectives: 1. To study the effect of different non-infectious (lactation status, partum number, milking session and milking fraction) and infectious (mammary gland health status) factors in milk EC readings (Assay 1). 2. To study the use of absolute EC thresholds to distinguish the health status of mammary glands (Assay 1). 3. To study the effect of the onset of intramammary infection in the EC of glandular milk and its evolution over time following infection (Assay 2). 4. To assess the mastitis detection potential of several algorithms based on daily measurement of the EC of glandular milk, using a laboratory conductivity meter and a prototype designed for daily automatic reading of milk EC at mammary gland level during mechanical milking (Assay 2).

In assay 1, two experiments were carried out to examine the effect of different infectious and non-infectious factors on milk EC readings and the use of absolute EC thresholds to distinguish the health status of mammary glands (Objectives 1 and 2). In experiment 1, we studied the effect of the health status of the glands and of various non- infective factors (lactation stage, milking session: morning or evening and lactation number) on the application of milk EC as a mastitis detection method in dairy sheep. Likewise, we also studied the relation between EC and milk composition (macro- composition and mineral content) and between EC and somatic cell counts (SCC). Finally, we evaluated the use of EC thresholds as a mastitis detection method. To this end, we monitored the glandular milk EC throughout two consecutive lactations, during which 42 and 43 ewes were controlled, respectively. Seven fortnightly checks were carried out, analysing the EC, SCC, composition and mineral content of glandular milk at morning and evening milkings. Before the morning milking, samples were taken aseptically for bacteriological analysis, whose results along with the SCC were used to classify the glands according to their sanitary status (healthy, latently infected or infected).

The lactation stage (higher EC values at the onset and end of lactation than halfway through), lactation number (higher EC in multiparous than in primiparous ewes), milking session (higher EC in the morning than in the afternoon) and health status (greater EC in the glands with infectious mastitis than in healthy ones and those with latent mastitis) all had a significant effect on the EC and SCC of the milk. EC of multiparous ewes was significantly higher than that recorded in primiparous ewes; this difference was observed in both milkings, regardless of lactation stage or health status of the glands. In general, the EC did not remain constant throughout lactation. The maximum EC value was recorded at the first control (two weeks post-partum), followed by a significant falloff between the second and fourth weeks of lactation. As of week four, the EC gradually dwindled until reaching the minimum value in the tenth week, although no further significant differences were observed between successive controls. In the last four weeks of the experiment, the EC increased, but failed to reach the values recorded at the onset of lactation. The correlation between EC and SCC was only significant when all the data were analysed (r=0.33) and for SCC≥ 600.000 cells/mL. The changes in milk fat content largely explain the variation in EC (R2partial=0.24). We also observed that, for the same EC threshold, the specificity (Sp) and sensitivity (Se) vary depending on the partum number or milking session. The point at which the best combination of Se and Sp was recorded was when applying a threshold of 4.3 mS/cm in the primiparous ewes (Se=63.64% and Sp=63.31%), but when applying this same threshold overall, even though a slightly higher Sp was obtained (64.67%), the Se dropped by 49.57%. In all cases, a lower PPV (Positive Predictive Value) was recorded. The maximum values recorded in multiparous ewes by applying a threshold of 5 mS/cm, but with this threshold we only obtained Se = 18.96%. In contrast, at no time was the NPV (Negative Predictive Value) below 80%. In experiment 2, we studied the effect of the milking fraction and health status of the mammary glands on milk EC, as well as the relation of EC with milk composition and the relationship between EC and SCC. Finally, as in experiment 1, we assessed the use of absolute EC thresholds as a detection method for mastitis in the different milking fractions. To do so, a single control was performed in which we analyse the EC, milk macro- composition and SCC of 178 glands of Manchega breed sheep in three milking fractions: the first 100 mL (F1); machine milk (F2); stripping milk (F3). For classification of the glands according to their health status, three bacteriological controls were performed (one week beforehand, on sampling day and one week thereafter) in which samples were taken aseptically before the morning milking for subsequent bacteriological seeding and analysis. Milking fraction, mammary gland health status and partum number of the ewes had a significant effect on EC and SCC. The interaction between health status and milked fraction only presented a significant effect on SCC. The EC recorded in F1 was higher than that recorded in F2, which in turn was higher than that recorded for F3. When classifying the glands according to health status, although there was a decrease in EC as milking occurred, there were no significant differences between F2 and F3 in the mastitic glands. The correlation between EC and SCC, although moderate, was significant in the three milk fractions. The changes in milk fat and lactose content explained to a great extent the variation in EC (R2partial = 0.45 and 0.30 respectively), with a negative relation observed between both variables and the EC of the milk. For the same EC threshold, the Sp and Se varied slightly depending on the milking fraction. The cut-off point of both curves was given for a threshold of 4.2, 4.1 and 4.0 mS / cm in F1, F2 and F3 respectively, with Se and Sp values below 55% in all three fractions. The PPV remained around 20% for thresholds below 4.4 mS/cm. Increasing the threshold above 4.4 mS / cm improved the PPV of the method, but gave rise to a loss of Se. The NPV it remained above 80% for all proposed thresholds. In assay 2, we carried out an experiment to study the effect of the onset of intramammary infection on the EC, SCC and production of the glands and its development in the post-infection period. We also evaluated the mastitis detection capacity of several algorithms based on daily measurement of the EC of glandular milk using a laboratory conductivity meter and a prototype designed for daily automatic reading of milk EC at mammary gland level during machine milking. To this end, we carried out a daily follow- up of the two milkings (morning and evening) to analyse the glandular EC and milk production of 26 sheep free of intramammary infection during 3.5 weeks. After this period, several unfavourable conditions for mammary gland health status which can occur in commercial farms were simulated, evaluating the health status of the glands during that period. The unfavourable conditions for mammary gland health status were prolonged until we had a sufficient number of infected glands, after which the experiment was extended for 3.5 weeks, during which daily monitoring of EC evolution and production was carried out, bacteriological analyses were performed and the SCC was measured. Milk samples were taken on the first day of the SDS to determine its composition and thereafter at 4, 7, 11, 18, 21 and 28 days following onset of the infection. With the EC values registered (with the laboratory conductivity meter and with the prototype) at both milkings, we studied the behaviour of different calculation algorithms based on detecting deviations from the EC record at consecutive milkings. The onset of intramammary infection caused an increase in SCC and a significant decrease in production, more pronounced in ewes infected bilaterally than unilaterally. The EC after on the onset of infection only rose significantly when the infection occurred bilaterally With the daily EC measurements, we applied several algorithms based on the detection of anomalous variations in EC of the individual gland and on variations of the RELCE (EC relation between collateral glands), observing better results when using the latter.

The best results (Se = 91.7%; Sp = 90.9%; PPV = 91.7% and NPV = 90.9%) were obtained when applying a rule based on the detection of a deviation in RELCE three times the typical deviation compared to the average for RELCE from the records taken during the previous 10 days (|RELCE - RELCEmed (10 days)| > 3 σ (10 days) ), taking into account the whole of the 5 days after the onset of infection. With data recorded by the prototype, we also obtained high scores for Se and Sp, although the PPV and NPV were lower, which was attributed to the decalibration of the equipment observed throughout the experiment. We therefore recommend that automatic calibration methods be included when developing equipment for online measurement of EC. In this experiment, the changes recorded in EC were explained to a great extent by the variation in lactose content (R2partial = 0.43). As for the correlation between EC and SCC, it was significant but moderate at both milkings, presenting a higher coefficient of correlation when SCC > 400,000 cells/mL and at the evening milking compared to the morning milking. Based on the outcomes, we may conclude that the EC of milk in Manchego breed ewes is closely related with the milk composition, so it can be used as a method for detecting mastitis as long as the infection causes damage to the mammary gland able to alter the milk composition. There are also other non-infectious factors affecting milk EC: lactation stage, lactation number, milking session (morning or evening) or the milking fraction. The use of absolute EC thresholds for mastitis detection is therefore not recommended. The use of calculation algorithms based on the comparison of the EC with previous daily EC measurements from the same gland that allow the detection of anomalous variations of the variable has obtained satisfactory results for mastitis detection. For proper “on-line” measurement of EC, further studios would be necessary, focusing on the design smaller-sized sensors that could be integrated into the short milk tube or milk cluster, fitted with an automatic calibration system, ensuring at all times that its manufacture is based on materials authorised for use in the food industry and which are not affected by the detergents used in the daily washing of milking machines.