Disección de los circuitos espinales subyacentes al dolor inflamatorio: conectividad neuronal y participación del canal iónico TRPA1

Abstract

El canal iónico TRPA1 es un canal catiónico no selectivo presente en varios tejidos, donde desempeña la función de sensor de estrés celular y daño tisular debido a su capacidad para detectar una plétora de señales de daño e irritantes ambientales. En el sistema somatosensorial, el canal se expresa en una subpoblación de neuronas sensoriales nociceptivas. Tanto la sensibilidad de TRPA1 a mediadores inflamatorios como su localización en los nociceptores, le confieren un papel central en la patogénesis de una gran variedad de síndromes inflamatorios, especialmente en el desarrollo de la hipersensibilidad característica de estos modelos. Sin embargo, la población que expresa TRPA1 no se ha logrado clasificar de manera inequívoca como perteneciente a uno de los dos grupos de nociceptores, peptidérgicos y no peptidérgicos, y tampoco se conoce la población de neuronas sensoriales de segundo orden con la que estas fibras hacen sinapsis en el asta dorsal de la médula espinal, lo que limita sustancialmente las posibilidades terapéuticas cuando se abordan estas patologías. Por otro lado, los procesos inflamatorios, además de ocasionar cambios fenotípicos en los nociceptores, entre los que se encuentran las neuronas sensoriales TRPA1+, también provocan modificaciones funcionales en las neuronas del asta dorsal de la médula espinal, que implican un aumento de la sensibilidad a los estímulos. En estas capas medulares se localizan distintas subpoblaciones de neuronas, y su conectividad y organización en circuitos determina cómo se procesan y amplifican las señales nociceptivas. No obstante, la diversidad de poblaciones neuronales y la plasticidad de las conexiones que éstas establecen, complica la caracterización de circuitos involucrados en modalidades sensoriales concretas. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido estudiar la población de neuronas sensoriales TRPA1+, su distribución, la expresión de marcadores de nociceptores en estas neuronas y el efecto que tiene su activación selectiva en la conducta de los ratones. Para ello, se utilizó una línea de ratón transgénico, el ratón TRPA1-Cre cruzado con el reportero ChR2-EYFP, en el que la expresión de la proteína fluorescente permitió la identificación de estas neuronas, y la canalrodopsina, su activación con luz. Se pudieron identificar neuronas TRPA1+ tanto en ganglios raquídeos (DRG), que inervan la superficie corporal, así como en neuronas que inervan vísceras como el estómago, que pertenecen fundamentalmente a la población de nociceptores no peptidérgicos y que hacen sinapsis con neuronas de segundo orden en las láminas superficiales de la médula espinal. Además, su activación con luz evocó comportamientos de retirada, retracción y especialmente de lamida, lo que confirma su identidad nociceptiva. El segundo objetivo ha sido caracterizar los circuitos de la médula espinal dorsal implicados en la transmisión de un estímulo nocivo en situaciones de dolor inflamatorio y examinar si estos circuitos se reactivan después de un estímulo inocuo en un contexto inflamatorio. Para ello, la herramienta utilizada ha sido la línea de ratón transgénico TRAP2-tdTomato, con el que se ha podido marcar permanente la población neuronal que se activa tras la aplicación de un estímulo de calor nocivo, tanto en condiciones control cómo de inflamación. Su análisis demostró que los circuitos espinales que integran la información nociceptiva no son estables en el tiempo, que la inflamación induce un aumento en el input glutamatérgico de las neuronas espinales y que las neuronas que integran la información nociceptiva térmica disparan de manera predominante potenciales de acción con un patrón tónico. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las neuronas TRPA1+ constituyen mayoritariamente una población de nociceptores no peptidérgicos cuya activación induce respuestas aversivas, y que las neuronas espinales de segundo orden integran la información nociceptiva en circuitos plásticos cuya actividad espontánea aumenta durante los procesos inflamatorios. Estos descubrimientos contribuyen a comprender mejor la naturaleza de estos procesos, abriendo la puerta a desarrollar terapias más efectivas que mejoren la calidad de vida de pacientes que padecen este tipo de síndromes. The TRPA1 ion channel is a non-selective cation channel present in various tissues, where it functions as a sensor of cellular stress and tissue damage due to its ability to detect a plethora of damage signals and environmental irritants. In the somatosensory system, the channel is expressed in a subpopulation of nociceptive sensory neurons. TRPA1’s sensitivity to inflammatory mediators, along with its localization in nociceptors, gives it a central role in the pathogenesis of a wide range of inflammatory syndromes, particularly in the development of the hypersensitivity of these models. However, the population expressing TRPA1 has not been unequivocally classified as part of the two nociceptor groups, peptidergic and non-peptidergic, and the population of second-order sensory neurons with which these fibers synapse in the dorsal horn of the spinal cord is also unknown, substantially limiting therapeutic possibilities when addressing these pathologies. On the other hand, inflammatory processes, in addition to causing phenotypic changes in nociceptors, including TRPA1+ sensory neurons, also induce functional modifications in dorsal horn neurons in the spinal cord, leading to increased sensitivity to stimuli. These spinal layers contain different neuronal subpopulations, and their connectivity and organization into circuits determine how nociceptive signals are processed and amplified. However, the diversity of neuronal populations and the plasticity of the connections they establish complicate the characterization of circuits involved in specific sensory modalities. The first objective of this doctoral thesis was to study the population of TRPA1+ sensory neurons, their distribution, the expression of nociceptor markers in these neurons, and the effect of their selective activation on mouse behavior. To this end, a transgenic mouse line was used, TRPA1-Cre crossed with the ChR2-EYFP reporter, in which the expression of the fluorescent protein allowed the identification of these neurons, and channelrhodopsin enabled their activation with light. TRPA1+ neurons were identified in the dorsal root ganglia (DRG), innervating the body surface, as well as in neurons innervating viscera such as the stomach. These mainly belong to the non-peptidergic nociceptor population and synapse with second-order neurons in the superficial laminae of the spinal cord. Furthermore, their activation by light evoked withdrawal, lifting, and especially licking behaviors, confirming their nociceptive identity. The second objective was to characterize the circuits in the dorsal spinal cord involved in transmitting a noxious stimulus during inflammatory pain and to examine whether these circuits are reactivated after an innocuous stimulus in an inflammatory context. For this, the tool used was the transgenic TRAP2-tdTomato mouse line, which allowed for the permanent labeling of the neuronal population activated after the application of a noxious heat stimulus, both in control and inflammatory conditions. Analysis demonstrated that the spinal circuits integrating nociceptive information are not stable over time, that inflammation induces an increase in the glutamatergic input to spinal neurons, and that the neurons integrating thermal nociceptive information predominantly fire action potentials with a tonic pattern. In conclusion, the results obtained in this work demonstrate that TRPA1+ neurons constitute a predominantly non-peptidergic nociceptor population whose activation induces aversive responses, and that second-order spinal neurons integrate nociceptive information in plastic circuits, whose spontaneous activity increases during inflammatory processes. These discoveries contribute to a better understanding of the nature of these processes, opening the door to the development of more effective therapies to improve the quality of life of patients suffering from these syndromes.