Estudio de los roles de INCURVATA11 y CUPULIFORMIS2 como proteínas accesorias del Polycomb Repressive Complex 2 de Arabidopsis

Abstract

Como primera parte de esta tesis se hizo una revisión de las publicaciones sobre la superfamilia de las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (también denominado 2-cetoglutarato o α-cetoglutarato) y Fe2+ (2OGD), que son enzimas oxidativas cuyo sitio activo incluye dos histidinas y en la mayoría de los casos un residuo de ácido aspártico o glutámico. Este motivo conservado cataliza reacciones de desmetilación, desmetilenación, hidroxilación, halogenación, desaturación, ruptura o cierre de anillos, y epimerización. El genoma de Arabidopsis contiene más de 150 genes que codifican proteínas 2OGD, a las que se ha clasificado en los clados DOXA, DOXB, DOXC y JMJ. Las proteínas DOXA son homólogas de la dioxigenasa dependiente de α-cetoglutarato AlkB (por Alkylation B) de Escherichia coli, una enzima de reparación del ADN que revierte las metilaciones de los átomos N1 de la adenina y N3 de la citosina causadas por agentes alquilantes. Las proteínas DOXC constituyen la clase más amplia y diversa de las 2OGD, actuando en facetas del metabolismo vegetal como la biosíntesis y/o el catabolismo de la auxina y los lignanos, isoprenoides, flavonoides, glucosinolatos, alcaloides, estrigolactonas y cumarinas, y tienen importantes papeles en la homeostasis del etileno, las giberelinas, la auxina y el ácido salicílico. Las proteínas JMJ contienen un dominio Jumonji C (JmjC) y catalizan la desmetilación por hidroxilación de lisinas en las histonas. Las proteínas DOXB animales juegan un papel crucial en la síntesis del colágeno, el componente estructural mayoritario del espacio extracelular de muchos tejidos. Algunas proteínas DOXB de las plantas modifican postraduccionalmente determinadas O-glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, como las extensinas, que son similares al colágeno. La familia CUPULIFORMIS (CP) incluye cinco proteínas DOXB: INCURVATA11 (ICU11), CP2, CP3, CP4 y CP5. A diferencia de todas las DOXB estudiadas hasta ahora, ICU11 y CP2 son nucleoplásmicas y tienen funciones epigenéticas. Antes del comienzo de esta tesis se habían descrito dos mutantes incurvata11 (icu11), que manifiestan hiponastia foliar y floración temprana. Estos rasgos morfológicos también los causan las mutaciones en genes que codifican algunos componentes de la maquinaria epigenética, como CURLY LEAF (CLF), que pertenece al grupo Polycomb (PcG). Las proteínas del PcG forman parte de dos Polycomb Repressive Complexes (PRC) heteromultiméricos con distintas actividades epigenéticas: el PRC1 es una ligasa de ubiquitina de la histona H2A, y el PRC2, una metiltransferasa de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27). El PRC1 de Arabidopsis tiene cinco componentes principales, y el PRC2, ocho, uno de los cuales es EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2). Estos PRC también cuentan con proteínas accesorias, que facilitan la incorporación del complejo a determinadas regiones de la cromatina. Un ejemplo de ello es EMBRYONIC FLOWER 1 (EMF1), que contribuye al depósito de la marca epigenética H3K27me3 en un subgrupo de los genes diana del PRC2 y también participa en la monoubiquitinación de la H2A por el PRC1. El fenotipo morfológico de los mutantes icu11 es relativamente débil, y los cp2 son indistinguibles del tipo silvestre. Sin embargo, los dobles mutantes icu11 cp2 muestran un fenotipo letal postembrionario muy similar al de los mutantes simples emf1 y emf2 más extremos: no manifiestan desarrollo vegetativo y forman órganos parecidos a flores inmediatamente después de la germinación, a los que se denomina flores embrionarias. También forma flores embrionarias el triple mutante telomere repeat binding1-2 (trb1-2) trb2-1 trb3-2. Las proteínas TRB1, TRB2 y TRB3 se unen a las secuencias repetitivas teloméricas para el mantenimiento de los telómeros y además son proteínas accesorias del PRC2, al que reclutan a determinados genes para el depósito de la marca H3K27me3. Col-0 es la estirpe silvestre de referencia y la de uso experimental más común en Arabidopsis. La redundancia funcional entre ICU11 y CP2 se infirió del estudio de los fenotipos sinérgicos de las combinaciones dobles mutantes y sesquimutantes de las mutaciones icu11 y cp2, cuyos fondos genéticos eran S96 (icu11-1), Ws-2 (icu11-2) y Col-0 (cp2-1, cp2-2 y cp2-3). En consecuencia, todas sus combinaciones genéticas tenían fondos genéticos híbridos S96/Col-0 o Ws-2/Col-0. Para evitar los eventuales efectos de los modificadores presentes en los fondos S-96 y Ws-2, la segunda parte de esta Tesis ha consistido en la obtención y caracterización de cuatro nuevos alelos de ICU11, mutagenizando las estirpes silvestres S96 (icu11-4 e icu11-7) y Col-0 (icu11-5 e icu11-6) mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Los alelos icu11-5 e icu11-6 son aparentemente nulos, ya que presentan pequeñas deleciones que desfasan la pauta de lectura del primer exón del gen ICU11 y originan un codón de terminación prematura, y no parecen haber sufrido mutaciones adicionales indeseadas. También manifiestan menor hiponastia foliar que icu11-1, aunque similares floración temprana e interacciones genéticas con los alelos mutantes de CP2. Hemos usado las mutaciones icu11-5 e icu11-6 para confirmar que la ausencia simultánea de las proteínas ICU11 y CP2 es letal y que los fenotipos de los dobles mutantes y sesquimutantes icu11 cp2 son independientes de su fondo genético y no manifiestan especificidad de alelo. En nuestro estudio de los mutantes icu11-5 cp2-1 y emf2-3 hemos establecido que su letalidad puede ser paliada si se cultivan en medio suplementado con un 3% en sacarosa, en lugar del 1% habitual, lo que a su vez permite estudiar su fenotipo morfológico a lo largo de todo su ciclo de vida. En esta condición de cultivo, las plantas icu11-5 cp2-1 y emf2-3 desarrollan tallos, hojas caulinares pequeñas, flores que manifiestan transformaciones homeóticas de sépalos y pétalos en carpelos, y silicuas que rinden semillas que solo en algunos casos resultan viables. Estas observaciones indican que la letalidad de las flores embrionarias icu11 cp2 y emf2-3 se debe a su escasa capacidad fotosintética, derivada de su carencia de hojas vegetativas, y que ICU11 y/o CP2 se requieren para la especificación de la identidad de los órganos florales. En la tercera parte de esta Tesis se ha intentado dilucidar la función de ICU11 y CP2 mediante análisis interactómicos y transcriptómicos. Durante el transcurso de esta Tesis, otros autores publicaron un artículo en el que se describía un tercer alelo de ICU11 (icu11-3) y se demostraba, mediante un ensayo de coinmunoprecipitación, que la proteína ICU11 interacciona con varios componentes principales del PRC2. Hemos realizado escrutinios de interactores de las proteínas ICU11 y CP2 mediante purificación por afinidad en tándem. Hemos confirmado así que ICU11 interacciona con los componentes principales del PRC2 EMF2, FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), SWINGER (SWN) y MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (MSI1) y con las proteínas accesorias de este complejo EMF1, TRB1, TRB2 y TRB3, y demostrado que también lo hace con otras proteínas nucleares. CP2 no presentó interacciones con componentes principales o proteínas accesorias del PRC2, aunque sí lo hizo con TRB4 y TRB5, miembros poco caracterizados de la familia TRB, y otras proteínas nucleares. También hemos realizado ensayos de complementación de fluorescencia bimolecular mediante transformación transitoria de hojas de Nicotiana benthamiana, en los que tanto ICU11 como CP2 interaccionaron con los componentes principales del PRC2 SWN y CLF, y con sus proteínas accesorias TRB1 y TRB3. No hemos encontrado interacción alguna entre ICU11 y CP2, lo que indica que no forman heteromultímeros. Hemos llevado a cabo mediante secuenciación masiva de ARN un análisis comparativo de los perfiles transcriptómicos de plántulas de Col-0, cp2-1 e icu11-5, flores embrionarias de icu11-5 cp2-1 y emf2-3, e inflorescencias de Col-0. Este análisis ha revelado la gran semejanza entre los perfiles del doble mutante icu11-5 cp2-1 y el mutante simple emf2-3, así como con los de otros mutantes portadores de alelos de genes que codifican componentes principales del PRC2. Muchos de los genes desregulados en las flores embrionarias icu11-5 cp2-1 son portadores de la marca represora H3K27me3 en Col-0. Considerados en conjunto, nuestros resultados confirman que ICU11 es una proteína accesoria del PRC2, revelan que muy probablemente CP2 también lo sea, y aportan nuevos indicios de su relación funcional y de sus funciones epigenéticas parcialmente solapantes.

As a first part of this Thesis, we reviewed the current knowledge on the 2-oxoglutarate (also known as 2-ketoglutarate or α-ketoglutarate) and Fe2+-dependent dioxygenase (2OGD) superfamily, which includes oxidative enzymes with an active site containing two histidines and, in most cases, one aspartic or glutamic acid residue. This conserved motif allows 2OGDs to catalyze demethylation, demethylenation, hydroxylation, halogenation, desaturation, ring cleavage, ring closure and epimerization reactions. The Arabidopsis genome contains more than 150 genes encoding 2OGD proteins, which have been classified into the DOXA, DOXB, DOXC and JMJ clades. DOXA proteins are homologs of the Escherichia coli α-ketoglutaratedependent dioxygenase AlkB (for Alkylation B), a DNA repair enzyme that reverses the N1-methyladenine and N3-methylcytosine lesions caused by alkylating agents. DOXCs are the largest and most functionally diverse class of 2OGDs, acting in plant metabolism, including biosynthesis and/or catabolism of lignans, isoprenoids, flavonoids, glucosinolates, alkaloids, auxin, strigolactones, and coumarins, and playing important roles in ethylene, gibberellin, auxin, and salicylic acid homeostasis. The Jumonji C (JmjC) domain-containing (JMJ) proteins function in the demethylation by hydroxylation of lysine residues in histones. Animal DOXBs play a key role in the biosynthesis of collagen, the main structural component of the extracellular space in many tissues. Some plant DOXBs catalyze post-translational modifications of cell wall hydroxyproline-rich O-glycoproteins, such as extensins, which are similar to collagen. The CUPULIFORMIS (CP) family includes five DOXBs: INCURVATA11 (ICU11), CP2, CP3, CP4 and CP5. Unlike all other studied DOXBs, ICU11 and CP2 are nucleoplasmic and have epigenetic functions. The two icu11 mutants described before the beginning of this Thesis have hyponastic leaves and early flowering, traits that they share with mutants affected in genes encoding some components of the epigenetic machinery, such as CURLY LEAF (CLF), a Polycomb-group (PcG) gene. PcG proteins form part of two heteromultimeric Polycomb Repressive Complexes (PRCs) with different epigenetic activities: PRC1 is a H2A ubiquitin ligase, and PRC2 a lysine 27 of histone H3 (H3K27) methyl transferase. PRCs have core components; for example, EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2) is one of the eight known core components of Arabidopsis PRC2. PRCs also have accessory proteins, which facilitate their recruitment to specific chromatin regions; for example, EMBRYONIC FLOWER1 (EMF1) contributes to H3K27me3 deposition in a subgroup of PRC2 target genes, and is also required for H2A monoubiquitination by PRC1. The icu11 mutants have the mild morphological phenotype mentioned above, and the cp2 mutants are indistinguishable from wild type. However, the icu11 cp2 double mutants exhibit a severe, post-embryonic lethal phenotype reminiscent of emf1 and emf2 single mutants: lack of vegetative development and formation of flower-like organs immediately after germination, the so-called embryonic flowers. Embryonic flowers are also developed by the telomere repeat binding1-2 (trb1-2) trb2-1 trb3-2 triple mutant. Arabidopsis TRB1, TRB2 and TRB3 bind to the telomeric repeat DNA sequences to maintain chromosome ends and are assumed to be PRC2 accessory proteins, given that they recruit this complex to certain genes for H3K27me3 deposition. Col-0 is the reference wild-type Arabidopsis accession and the most commonly used. The unequal functional redundancy between ICU11 and CP2 was inferred from the study of the synergistic phenotypes of the double mutant and sesquimutant combinations of icu11 and cp2 mutations, which had been isolated in the S96 and Col-0 genetic backgrounds, respectively. Therefore, all their genetic combinations had S96/Col-0 or Ws-2/Col-0 hybrid genetic backgrounds. In the second part of this Thesis and to avoid potential confounding effects arising from different genetic backgrounds, we generated via CRISPR/Cas9 genome editing the icu11-4 and icu11-7 mutants in the S96 background, and icu11-5 and icu11-6 in Col-0. The latter mutants carry apparently null alleles of ICU11, since they carry small deletions that cause frameshifts in the first exon of this gene, which in turn originate premature stop codons, and lack undesired offtarget mutations. The icu11-5 and icu11-6 mutants also show leaf hyponasty to a lesser extent than Col-0, but equivalent early flowering and synergistic genetic interactions with cp2 alleles. We used the icu11-5 e icu11-6 mutants to confirm that the simultaneous absence of ICU11 and CP2 is lethal and to demonstrate that the unequal functional redundancy of ICU11 and CP2 and demonstrated that it is not allele or genetic background specific. In our study of the icu11 cp2 and emf2-3 mutants, we found that an increase from 1% to 3% in sucrose content in the culture medium partially rescues their post-germinative lethality, allowing the study of their morphological phenotypes throughout the entire life cycle. In such culture condition, icu11 cp2 and emf2-3 developed shoots, small cauline leaves, flowers exhibiting homeotic transformations of sepals and petals into carpels, and siliques that rendered seeds that in only a few cases were viable. These observations indicate that the lethality of the icu11 cp2 and emf2-3 embryonic flowers is caused by their poor photosynthetic capacity, as a consequence of their lack of rosette leaves. We thus established that ICU11 and/or CP2 are required for proper floral organ identity specification. In the third part of this Thesis, we attempted to assess the function of ICU11 and CP2 through interactomic and transcriptomic analyses. During the course of the current Thesis, other authors described a third allele of ICU11 (icu11-3), found using co-immunoprecipitation that ICU11 interacts with several PRC2 core components, and thus proposed that it is a PRC2 acessory protein. We performed a Tandem Affinity Purification (TAP)-based screen for interactors of ICU11 and of CP2. In our TAP assays, ICU11 interacted with the PRC2 core components EMF2, FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE), SWINGER (SWN) and MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (MSI1) and with the PCR2 accessory proteins EMF1, TRB1, TRB2 and TRB3, as well as with other nuclear proteins. CP2 did not interact with PRC2 core components, neither with TRB1, TRB2 or TRB3, but it did with TRB4 and TRB5, poorly characterized members of the TRB family, and other nuclear proteins. Through Bimolecular Fuorescence Complementation (BiFC) assays by transient transformation of Nicotiana benthamiana leaves, we found both ICU11 and CP2 to interact with the PRC2 core components SWN y CLF, as well as with the PRC2 accessory proteins TRB1 y TRB3. No interaction between ICU11 and CP2 was detected by TAP or BiFC, indicating that these proteins do not heteromultimerize. We also conducted RNA-seq analyses of the Col-0, cp2-1 and icu11-5 seedlings, icu11-5 cp2-1 and emf2-3 embryonic flowers and Col-0 inflorescences, which revealed strong similarities in the transcriptomic profiles of icu11-5 cp2-1 with emf2-3 and with other single mutants affected in genes encoding PRC2 core components. A significant proportion of the genes misregulated in icu11-5 cp2-1 are known to harbor H3K27me3 repressive marks in Col-0. Taken together, our results confirm that ICU11 is a PRC2 accessory protein, reveal that CP2 is also a likely PRC2 accessory protein, and provide further genetic and molecular evidence of the functional relationship of ICU11 and CP2, and of their partially overlapping epigenetic functions.