Bases genéticas y moleculares de la fenología y la calidad del fruto en ciruelo japonés (Prunus salicina Lindl.) y estudio de la transmisión de la autocompatibilidad y resistencia al virus de la Sharka (Plum pox virus) en híbridos interespecíficos ciruelo japonés x albaricoquero (P. salicina x P. armeniaca L.)

Abstract

El ciruelo japonés (Prunus salicina Lindl.) es uno de los frutales de hueso más cultivados en el mundo, ocupando el segundo lugar en producción después del melocotonero, con una producción global de más de 12 millones de toneladas. Sin embargo, el cultivo del ciruelo japonés presenta una serie de deficiencias y problemas que deben ser abordados para asegurar su viabilidad y rentabilidad. Una de las principales dificultades radica en el limitado elenco varietal disponible para el cultivo, donde la producción mundial depende todavía en gran medida de un número limitado de variedades tradicionales. Un aspecto de gran relevancia y complejidad en el cultivo de esta especie es la generalizada autoincompatibilidad floral, con solo unas pocas variedades comerciales autocompatibles, lo que hace necesario el diseño de las plantaciones con variedades polinizadores, intercompatibles y coincidentes en época de floración. Otro problema grave que afecta sobre todo a la Región de Murcia y a la Comunidad Valenciana es la incidencia de la enfermedad de la sharka, causada por el potyvirus plum pox virus, que provoca importantes daños en esta especie afectando tanto a la calidad como a la producción. Este problema conlleva una difícil solución, ya que no se dispone de fuentes de resistencia al virus en ciruelo japonés y la totalidad de las variedades cultivadas son susceptibles. La calidad del fruto es otro aspecto a mejorar en la especie, ya que parte de las variedades cultivadas no alcanzan los parámetros de calidad requeridos por la industria comercializadora y los consumidores. Un color atractivo de piel y pulpa, firmeza, sabor y buena aptitud poscosecha son los principales caracteres a considerar en las nuevas variedades. La necesidad de afrontar estos desafíos derivados de las problemáticas del cultivo, la evolución de la demanda y expectativas de los consumidores, la creciente competencia de los mercados, así como los nuevos retos tecnológicos, agronómicos y medioambientales, incluyendo el impacto del cambio climático y la sostenibilidad ecológica, requieren de programas de mejora genética que den respuesta a estas necesidades mediante la obtención de nuevas variedades de alto valor y excelencia que incrementen la diversidad genética y fenotípica de la especie. Sin embargo, la mejora de esta especie, al igual que otros cultivos leñosos, presenta unos ciclos de mejora muy extensos debido a los largos periodos de juvenilidad, su biología reproductiva compleja y el alto grado de heterocigosidad que presenta. En la actualidad, existen programas de mejora genética de ciruelo japonés alrededor de todo el mundo, y aunque los programas de mejora más avanzados se encuentran principalmente en California, se están llevando a cabo esfuerzos significativos en otros países como China, Japón, Chile, Sudáfrica, Australia y España. Estos programas de mejora se fundamentan en los procedimientos clásicos, basados en cruzamientos dirigidos, generación de progenies, evaluación de descendencias y selección de genotipos de interés en base a sus características fenotípicas, lo que requiere de largos periodos de tiempo, un trabajo ingente de campo y laboratorio y un elevado coste económico. El uso de herramientas biotecnológicas, tales como la selección asistida por marcadores (MAS) y de la genómica, puede ayudar a optimizar los programas de mejora de ciruelo japonés, mejorando significativamente su eficiencia y reduciendo el tiempo requerido para la obtención final de nuevas variedades. En este sentido, la disponibilidad de marcadores moleculares en la especie ciruelo japonés es actualmente muy limitada, focalizándose principalmente en la identificación de los alelos de incompatibilidad, lo que facilita la evaluación de la compatibilidad entre genotipos y la planificación estratégica de los cruzamientos. Más recientemente, se han desarrollado marcadores moleculares para el color de la piel y el color de la pulpa, permitiendo la determinación de la presencia o ausencia de pigmentación roja en ambos tejidos. En este contexto, la Tesis Doctoral se ha realizado en el marco del programa de mejora genética del ciruelo japonés desarrollado conjuntamente por el CEBAS-CSIC y el IMIDA, iniciado en 2011 en la Región de Murcia, cuyos principales objetivos son la obtención de variedades de bajas necesidades de frío, que se adapten a las condiciones climáticas actuales y futuras, autocompatibles, de maduración temprana (mayo, junio), alta productividad, elevada calidad del fruto, y, en lo posible, resistentes al virus de la enfermedad de la sharka mediante la generación de híbridos interespecíficos realizando cruzamientos con variedades resistentes y autocompatibles de albaricoquero (plumcots). El objetivo general de esta tesis doctoral ha sido el estudio de las bases genéticas y moleculares de los principales caracteres implicados en la fenología y calidad del fruto en ciruelo japonés, así como la caracterización fenotípica y molecular de híbridos interespecíficos ciruelo japonés × albaricoquero (plumcots), incluyendo la validación de su naturaleza interespecífica, la evaluación de la resistencia al virus de la sharka (PPV) y la determinación de alelos de compatibilidad floral. Para ello, dentro de la línea de trabajo intraespecífica se ha realizado una caracterización fenotípica durante tres años de estudio y se ha estudiado el modo de herencia de los principales caracteres fenológicos y de calidad del fruto en tres poblaciones F1 segregantes de ciruelo japonés (‘Black Splendor’ × ‘Pioneer’ (‘BS×PIO’), ‘Red Beaut’ × ‘Black Splendor’ (‘RB×BS’) y ‘Red Beaut’ × ‘Santa Rosa Precoz’ (‘RB×SRP’)). Además, se ha llevado a cabo la caracterización molecular de las tres poblaciones implementando una estrategia de genotipado novedosa en frutales, no empleada anteriormente en ciruelo japonés ni en otras especies del género Prunus, que reduce los costes en el proceso mediante la combinación de alta cobertura (Whole Genome Sequencing, WGS) de los parentales y baja cobertura (Low Coverage Whole Genome Sequencing, LcWGS) de las descendencias, con el fin de elaborar mapas de ligamiento genético e identificar regiones del genoma asociadas a caracteres de interés (QTLs) de fenología y calidad del fruto. Por otro lado, dentro de la línea de trabajo interespecífica, se ha llevado a cabo una caracterización fenotípica y molecular de los híbridos interespecíficos resultantes de los cruzamientos entre variedades de interés de ciruelo japonés y variedades de albaricoquero resistentes a PPV y autocompatibles, lo que ha permitido el estudio de la transmisión de la resistencia a PPV y la autocompatibilidad floral desde el albaricoquero al ciruelo en los híbridos interespecíficos. En cuanto a los resultados obtenidos, podemos destacar que los resultados derivados de la caracterización fenotípica y estudio del modo de herencia de los principales caracteres fenológicos y de calidad del fruto en las tres poblaciones de ciruelo japonés objeto de estudio (Capítulo 3) muestran una gran diversidad y segregación fenotípica en todos los caracteres evaluados, lo que corrobora la naturaleza segregante de las poblaciones, condición indispensable para abordar los objetivos planteados en la presente tesis doctoral. Además, se ha observado una alta variabilidad en las descendencias de las tres poblaciones, presentando fenotipos transgresivos en comparación con los progenitores en todos los caracteres fenológicos y de calidad del fruto, lo que puede atribuirse a la influencia del fondo genético de los parentales. Un ejemplo muy representativo es la presencia de genotipos con coloración de piel amarilla en la descendencia de las poblaciones ‘RB×BS’ y ‘RB×SRP’, a pesar de que ninguno de los parentales exhibe esta característica, lo que demuestra la significativa influencia del patrimonio genético de las variedades ‘RB’ y ‘SRP’, que poseen pedigríes complejos, producto de cruzamientos entre distintas especies de Prunus. Por otro lado, los análisis estadísticos y los histogramas de frecuencias realizados revelan una distribución no paramétrica en todos los caracteres fenológicos evaluados y en la mayoría de los caracteres físicos que determinan la calidad del fruto, con la excepción del peso y diámetro, que presentan una distribución normal. Asimismo, todos los caracteres organolépticos analizados exhiben una distribución normal en las tres poblaciones. Destaca el color de pulpa en las poblaciones ‘BS×PIO’ y ‘RB×BS’, que presenta una distribución bimodal, diferenciando entre genotipos con pulpa roja y pulpa amarilla. Sin embargo, la población ‘RB×SRP’ muestra una distribución asimétrica negativa, abarcando desde una coloración de pulpa anaranjada y bicolor hasta un color amarillo. La mayoría de los caracteres evaluados muestran una herencia cuantitativa, que avala su naturaleza poligénica, excepto el color de pulpa, que muestra una herencia cualitativa debido presumiblemente a su carácter oligogénico o monogénico. Por último, se han obtenido correlaciones altamente significativas entre los distintos caracteres evaluados, pudiendo destacar las observadas entre las distintas fechas de floración (inicio, plena y final), y entre la fecha de maduración y el periodo de desarrollo del fruto. También se han observado correlaciones significativas entre el periodo de desarrollo del fruto, el peso y el diámetro, la fecha de maduración, el periodo de desarrollo del fruto y la firmeza, el periodo de desarrollo del fruto, la firmeza y el contenido en sólidos solubles, entre otras. La implementación de la novedosa estrategia de genotipado combinando la secuenciación de los parentales a alta cobertura (Whole Genome Sequencing, WGS) y a baja cobertura las descendencias (Low Coverage Whole Genome Sequencing (LcWGS) (Capítulo 4), ha permitido desarrollar con éxito mapas de ligamiento genético en todos los parentales de las tres poblaciones evaluadas y, posteriormente, identificar un elevado número de QTLs ligados a los principales caracteres de fenología y calidad del fruto de una manera más eficiente económicamente en comparación con las técnicas empleadas con anterioridad en esta especie. Los mapas de ligamiento generados muestran características similares de tamaño y número de SNPs mapeados a los desarrollados previamente por otros autores con otras estrategias de genotipado más costosas. Si bien, esta técnica ha presentado algunas dificultades debido al empleo de la baja cobertura en las descendencias, ya que algunos grupos de ligamiento están representados por segmentos no conectados. En un número elevado de QTLs se han identificado SNPs asociados a la expresión de muchos de los caracteres evaluados, que presentan un efecto alélico significativo y estable durante los tres años de estudio, cuya validación en futuros trabajos puede facilitar el desarrollo de marcadores moleculares específicos para su uso en mejora asistida, y así reducir los tiempos y recursos empleados dentro de un programa de mejora genética clásico. Cabe destacar que la mayoría de los SNPs de los QTLs ligados a la fecha de floración en las tres poblaciones evaluadas presentan un efecto alélico significativo vinculado a una fecha de floración tardía, excepto los identificados en el parental ‘PIO’ de la población ‘BS×PIO’ y en el parental ‘BS’ de la población ‘RB×BS’, que están asociados a una fecha de floración temprana. Además, se han identificado por primera vez en la especie ciruelo japonés QTLs ligados a la intensidad de floración y la productividad, cuyos SNPs presentan distintos efectos alélicos en función del parental y grupo de ligamiento. Asimismo, la mayoría de los QTLs ligados a la fecha de maduración y periodo de desarrollo del fruto se encuentran localizados en regiones similares de los grupos de ligamiento en función de la población donde se han identificado. Se ha identificado el primer QTL ligado a la fisiopatía de hueso roto en frutales del género Prunus, siendo el identificado en el GL 5 del parental ‘BS’ de la población ‘BS×PIO' el único estable durante los tres años de fenotipado, donde los genotipos que presentan el SNP de este QTL muestran una menor incidencia de dicho desorden. En cuanto a los caracteres de color de piel y color de pulpa del fruto destacan los grupos de ligamiento 3 y 5 por presentar en ellos los QTLs con mayor significancia. Además, se han asociado SNPs a la expresión de color de piel amarillo, rojo, violáceo y negro, así como a colores de pulpa amarillo, rojo y bicolor según el grupo de ligamiento en el que se han identificado. Por último, en lo referente a los resultados obtenidos respecto a los caracteres organolépticos, se han identificado por primera vez QTLs estables durante tres años de fenotipado asociados al contenido en sólidos solubles, acidez y pH del fruto, destacando el GL5, donde se ha identificado el mayor número de QTLs estables. En cuanto a los resultados obtenidos en la línea interespecífica (Capítulo 5), el presente estudio demuestra el reto que supone generar híbridos interespecíficos Prunus salicina Lindl. × Prunus armeniaca L. (plumcots), teniendo tasas de éxito de hibridación muy bajas, influenciadas por la dirección del cruzamiento, siendo solo viables los que interviene P. salicina como parental materno. La naturaleza interespecífica de los híbridos ha sido verificada con éxito empleando marcadores moleculares tipo SSR, ya que todos los híbridos confirmados presentaban un alelo derivado del ciruelo japonés y otro del albaricoquero, lo que además pone de manifiesto la alta transferibilidad de los marcadores empleados entre especies de Prunus. Estos híbridos muestran relaciones genéticas más similares con los albaricoqueros, presentando además características fenotípicas propias de dicha especie como la morfología de las hojas, la pubescencia del gineceo y del fruto, entre otros. Por otro lado, los alelos S de incompatibilidad se genotiparon con éxito en todos los híbridos, segregando para la mayoría el alelo Sc que confiere la autocompatibilidad al albaricoquero, por lo que a priori tendrían que ser autocompatibles y autofértiles. Sin embargo, los estudios de viabilidad del polen han mostrado androesterilidad en todos los plumcots que florecieron, lo que sugiere que dicha hibridación interespecífica provoca androesterilidad en la descendencia. En cuanto a la evaluación de la resistencia a PPV, tanto por fenotipado como genotipado, los resultados obtenidos no coincidían con la resistencia esperada, ya que la mayoría de los plumcots clasificados genéticamente como resistentes, al presentar los alelos que confieren resistencia a PPV en albaricoquero, no mostraron resistencia en la evaluación fenotípica. Sin embargo, sí que se han identificado plumcots tolerantes, es decir, no presentan síntomas de la enfermedad, aunque mostraban resultados positivos de ELISA y RT-PCR en laboratorio. La mayoría de plumcots tolerantes portaban los alelos asociados a la resistencia, por lo que la presencia del alelo de resistencia podría ser el resultado de una disminución de la susceptibilidad, con un grupo importante de plumcots susceptibles que se convierten en tolerantes/resistentes tras el primer ciclo de fenotipado. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la existencia de importantes retos por resolver en los cruzamientos interespecíficos, como la androesterilidad o la resistencia total a PPV, así como la correcta validación fenotípica y genotípica de los plumcots, a fin de evitar la incorrecta denominación de “plumcots” de genotipos de ciruelo que en realidad no proceden de cruzamientos ciruelo × albaricoquero

Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) is one of the most widely cultivated stone fruit trees in the world, ranking second in production after peach, with a global production exceeding 12 million tons. However, in Spain, the cultivation of Japanese plum faces a series of deficiencies and challenges that must be addressed to ensure its viability and profitability. One of the main difficulties lies in the limited varietal assortment available for cultivation, with global production still heavily reliant on a limited number of traditional cultivars. A highly relevant and complex aspect of cultivating this species is its floral self-incompatibility, with only a few commercially self-compatible varieties, necessitating the design of plantations with pollinator varieties that are inter-compatible and have synchronized blooming periods. Another significant issue, particularly affecting the Region of Murcia and the Valencian Community, is the incidence of Sharka disease, caused by the plum pox virus (PPV), which causes considerable damage to this species, impacting both quality and yield. This problem presents a challenging solution, as there are no sources of resistance to the virus in Japanese plum, and all cultivated varieties are susceptible. Fruit quality is another aspect requiring improvement in this species, as some of the cultivated varieties do not meet the quality parameters demanded by the commercial industry and consumers. Attractive skin and flesh color, firmness, flavor, and good postharvest performance are the main characteristics to be considered in new varieties. The necessity to address these challenges arising from cultivation issues, the evolution of consumer demand and expectations, the growing market competition, as well as new technological, agronomic, and environmental challenges —including the impact of climate change and ecological sustainability, —requires genetic improvement programs that respond to these needs by developing new high-value and excellent varieties that increase the genetic and phenotypic diversity of the species. However, the improvement of this species, like other woody crops, entails very long improvement cycles due to the extended juvenility periods, complex reproductive biology, and high degree of heterozygosity. Currently, there are Japanese plum breeding programs around the world, and although the most advanced breeding programs are primarily in California, significant efforts are being made in other countries such as China, Japan, Chile, South Africa, Australia, and Spain. These breeding programs are based on classical procedures, including directed crosses, progeny generation, offspring evaluation, and genotype selection based on phenotypic characteristics, which require long periods of time, extensive field and laboratory work, and high economic costs. The use of biotechnological approaches, such as marker-assisted selection (MAS) and genomics, can help optimize Japanese plum breeding programs, significantly improving their efficiency and reducing the time required to develop new varieties. In this regard, the availability of molecular markers in Japanese plum is currently very limited, mainly focusing on the identification of incompatibility alleles, which facilitates the assessment of compatibility between genotypes and the strategic planning of crosses. More recently, molecular markers have been developed for skin color and flesh color, allowing the determination of the presence or absence of red pigmentation in both tissues. In this context, the Doctoral Thesis has been carried out within the framework of the Japanese plum breeding program developed jointly by CEBAS-CSIC and IMIDA, initiated in 2011 in the Region of Murcia. The main objectives are to obtain varieties with low chilling requirements, adapted to current and future climatic conditions, self-compatible, early maturing (May, June), highly productive, with high fruit quality, and, if possible, resistant to the Sharka disease virus through the generation of interspecific hybrids by crossing with resistant and self-compatible apricot varieties (plumcots). The overall objective of this doctoral thesis has been to study the genetic and molecular bases of the main traits involved in the phenology and fruit quality of Japanese plum, as well as the phenotypic and molecular characterization of Japanese plum × apricot (plumcot) interspecific hybrids. This includes the validation of their interspecific nature, the evaluation of resistance to the sharka virus (PPV), and the determination of floral compatibility alleles. To achieve this, within the intraspecific work line, a three-year phenotypic characterization has been conducted, and the inheritance patterns of the main phenological and fruit quality traits have been studied in three segregating F1 populations of Japanese plum ('Black Splendor' × 'Pioneer' ('BS×PIO'), 'Red Beaut' × 'Black Splendor' ('RB×BS'), and 'Red Beaut' × 'Santa Rosa Precoz' ('RB×SRP')). Additionally, molecular characterization of the three populations has been carried out by implementing a novel genotyping strategy in fruit trees, not previously used in Japanese plum or other species of the genus Prunus. This approach reduces costs by combining high coverage (Whole Genome Sequencing, WGS) of the parents and low coverage (Low Coverage Whole Genome Sequencing, LcWGS) of the progeny to develop genetic linkage maps and identify genome regions associated with traits of interest (QTLs) related to phenology and fruit quality. Furthermore, within the interspecific work line, phenotypic and molecular characterization of the interspecific hybrids resulting from crosses between Japanese plum varieties of interest and PPV-resistant, self-compatible apricot varieties has been performed. This has enabled the study of the transmission of PPV resistance and floral self- compatibility from apricot to plum in the interspecific hybrids. Regarding the results obtained, it is worth highlighting that the findings from the phenotypic characterization and inheritance study of the main phenological and fruit quality traits in the three Japanese plum populations under study (Chapter 3), show a great diversity and phenotypic segregation in all evaluated traits, corroborating the segregating nature of the populations—an essential condition for addressing the objectives of this doctoral thesis. Additionally, high variability was observed in the progeny of the three populations, presenting transgressive phenotypes compared to the parents in all phenological and fruit quality traits, which can be attributed to the genetic background influence of the parents. A very representative example is the presence of genotypes with yellow skin coloration in the progeny of the ‘RB×BS’ and ‘RB×SRP’ populations, despite neither parent exhibiting this characteristic, demonstrating the significant influence of the genetic heritage of the ‘RB’ and ‘SRP’ varieties, which have complex pedigrees resulting from crosses between different Prunus species. Moreover, statistical analyses and frequency histograms reveal a non-parametric distribution in all evaluated phenological traits and in most physical traits determining fruit quality, except for weight and diameter, which exhibit a normal distribution. Similarly, all analyzed organoleptic traits show a normal distribution in the three populations. Notably, flesh color in the ‘BS×PIO’ and ‘RB×BS’ populations exhibits a bimodal distribution, distinguishing between genotypes with red and yellow flesh. However, the ‘RB×SRP’ population shows a negatively skewed distribution, ranging from orange and bicolor flesh coloration to yellow. Most evaluated traits exhibit quantitative inheritance, supporting their polygenic nature, except for flesh color, which shows qualitative inheritance likely due to its oligogenic or monogenic nature. Finally, highly significant correlations were found between various evaluated traits, particularly those observed between different flowering dates (beginning, full, and end), and between the ripening date and fruit development period. Significant correlations were also observed between the fruit development period, weight and diameter, ripening date, fruit development period and firmness, fruit development period, firmness, and soluble solids content, among others. The implementation of the novel genotyping strategy, combining high coverage sequencing of the parents (Whole Genome Sequencing, WGS) and low coverage sequencing of the progeny (Low Coverage Whole Genome Sequencing, LcWGS) (Chapter 4), has successfully allowed the development of genetic linkage maps for all parents of the three evaluated populations. Subsequently, a large number of QTLs linked to the main phenological and fruit quality traits were identified in a more economically efficient manner compared to previously used techniques in this species. The generated linkage maps exhibit similar characteristics in terms of size and number of mapped SNPs to those developed by other authors using more expensive genotyping strategies. However, this technique has encountered some difficulties due to the use of low coverage in the progeny, resulting in some linkage groups being represented by unconnected segments. A significant number of QTLs have been identified with SNPs associated with the expression of many evaluated traits, showing a significant and stable allelic effect over the three years of study. Validation of these QTLs in future work can facilitate the development of specific molecular markers for use in marker-assisted breeding, thereby reducing the time and resources required in a traditional breeding program. It is noteworthy that most of the SNPs from the QTLs linked to flowering date in the three evaluated populations show a significant allelic effect associated with a late flowering date, except for those identified in the parent 'PIO' of the 'BS×PIO' population and in the parent 'BS' of the 'RB×BS' population, which are associated with an early flowering date. Additionally, QTLs linked to flowering intensity and productivity have been identified for the first time in the Japanese plum species, with SNPs showing different allelic effects depending on the parent and linkage group. Similarly, most QTLs linked to the ripening date and fruit development period are located in similar regions of the linkage groups depending on the population in which they were identified. The first QTL linked to split-pit disorder in fruit trees of the genus Prunus has been identified, with the one identified in linkage group 5 of the 'BS' parent in the 'BS×PIO' population being the only one stable over the three years of phenotyping. Genotypes presenting the SNP of this QTL show a lower incidence of this disorder. Regarding skin and flesh color traits, linkage groups 3 and 5 stand out for having the most significant QTLs. Additionally, SNPs have been associated with the expression of yellow, red, purple, and black skin color, as well as yellow, red, and bicolor flesh color, depending on the linkage group in which they were identified. Finally, concerning the results obtained for organoleptic traits, stable QTLs over three years of phenotyping have been identified for the first time, associated with soluble solids content, acidity, and fruit pH. Linkage group 5 is particularly noteworthy for having the highest number of stable QTLs identified. Regarding the results obtained in the interspecific line (Chapter 5), this study demonstrates the challenge of generating Prunus salicina Lindl. × Prunus armeniaca L. (plumcots) interspecific hybrids, having very low hybridization success rates, influenced by the direction of the cross, with only those involving P. salicina as the maternal parent being viable. The interspecific nature of the hybrids has been successfully verified using SSR molecular markers, as all confirmed hybrids presented one allele derived from the Japanese plum and another from the apricot, highlighting the high transferability of the markers used between Prunus species. These hybrids show genetic relationships more similar to apricots, also presenting phenotypic characteristics typical of that species, such as leaf morphology, gynoecium pubescence, and fruit pubescence, among others. Moreover, the S alleles of incompatibility were successfully genotyped in all hybrids, with most segregating for the Sc allele that confers self-compatibility to apricot, suggesting that they should be self-compatible and self-fertile. However, pollen viability studies have shown male sterility in all plumcots that flowered, suggesting that this interspecific hybridization causes male sterility in the progeny. Regarding the evaluation of PPV resistance, both phenotyping and genotyping results did not match the expected resistance, as most plumcots genetically classified as resistant, having the alleles that confer PPV resistance in apricot, did not show resistance in phenotypic evaluation. However, tolerant plumcots were identified, showing no symptoms of the disease despite positive ELISA and RT-PCR results in the laboratory. Most tolerant plumcots carried the alleles associated with resistance, suggesting that the presence of the resistance allele could result in reduced susceptibility, with a significant group of susceptible plumcots becoming tolerant/resistant after the first phenotyping cycle. The results highlight significant challenges to be resolved in interspecific crossings, such as male sterility or total PPV resistance, as well as the correct phenotypic and genotypic validation of plumcots, to avoid the incorrect designation of "plumcots" for plum genotypes that do not actually result from plum × apricot crosses