Innovative pre-and post-harvest treatments with melatonin and ϒ-aminobutyric acid to increase yield and quality of lemons at harvest and during storage

Abstract

Citrus fruits, and particularly lemons, are a group of fruits that are highly appreciated throughout the world both for their organoleptic and nutritional quality, as well as for their various technological uses, which make them a highly valuable product for the food industry. However, if lemons have gained relevance in recent years, it is undoubtedly due to their high content of bioactive compounds of diverse nature, such as L-ascorbic acid (commonly known as vitamin C), flavanones, flavones or hydroxycinnamic acids, which have proven to have multiple health benefits due to their strong antioxidant activity. Citrus fruits have conquered the whole world and their cultivation is centralised around 40º north latitude and 40º south latitude, which allows us to understand why the Mediterranean Levant is undoubtedly the star location for citrus fruits in Spain. Of all Spanish fruit and vegetable production in 2022, the citrus sub- sector was second in terms of quantity, with 23% of national production. With regard to the fruit of the lemon tree (Citrus limon (L.) Burm. F), Spain, with a production of 900,000 tonnes in the 2022/2023 season, is the third largest producer in the world and the first in the European Union. The commercial value of the lemon is beyond any doubt if we consider that, of this national production, almost 70% is exported outside our borders, with Germany as the main importer. Low temperature preservation, one of the most widely used technologies to preserve the post-harvest quality of fruits, is necessary for marketing. However, fruits of certain citrus species and varieties are sensitive to develop chilling damage at temperatures below 5 °C, as well as to fungal infections, factors that depreciate their quality and marketability. All this, together with the growing concern of consumers and the limitation by European legislation on the use of traditional phytochemicals, opens up new lines of research. Recently, research has been carried out to find pre- and post-harvest treatments with natural compounds to replace those traditionally used, in order to increase the quality of the fruit at the time of harvesting and maintain it during storage, due to consumer concerns and legal restrictions on the use of chemical treatments both before and after harvesting. In this regard, the application of naturally occurring and plant-derived compounds as pre- or post-harvest treatments to delay ripening and senescence, preserving the quality of fruits and vegetables, has received considerable attention. Among these compounds, -aminobutyric acid (GABA) and melatonin (MEL) are compounds that are ubiquitous in plants and are found in the fruit and vegetable sector and are involved in numerous physiological processes of their development, such as defence against biotic and abiotic stresses. The scientific literature on the effect of pre- and post-harvest application of these compounds on lemon quality is limited. Therefore, the aim of this PhD Thesis is to solve lemon quality problems by pre-harvest treatments with ϒ-aminobutyric acid and melatonin, and post-harvest treatments with MEL to solve mainly the common physiological problems of two different landraces ('Fino' grafted on Citrus macrophylla and 'Verna' grafted on Citrus aurantium) at the time of harvesting, as well as their quality losses during cold storage due to the incidence of chilling injury and/or fungal infections, as well as dehydration and over-ripening, with the ultimate aim of increasing their shelf- life. In addition, it was assessed whether the treatments had an effect on the total crop yield. Pre-harvest treatments were carried out by foliar spraying at 10, 50 and 100 mM concentrations for the GABA compound on both lemon varieties, containing 0.5 % Tween 20 as surfactant. For MEL, the concentrations used in both lemon cultivars were 0.1, 0.3 and 0.5 mM, also with 0.5 % Tween 20. The treatments applied after fruit harvesting were divided into two different experiments: on the one hand, freshly harvested fruits of the Fino variety were immersed in melatonin solutions at concentrations of 0.01, 0.1 and 1 mM. On the other hand, Verna lemon fruits were immersed in 10 mM melatonin to make juice that would later be used in an in vivo trial with mice to test its effect on health. In all the pre-harvest experiments, the crop yield in the field and the quality of the fruit at the time of harvesting were evaluated and storage experiments were carried out at 2 and 10 °C for 28 days, evaluating each week, from the first day, the organoleptic (colour and firmness), nutritional (total soluble solids content (TSS) and total acidity (TA)) and functional quality (total phenol content (TPC) in the skin and in the juice and total antioxidant activity (TAA)). Cold storage was also carried out in the first post-harvest experiment. The results of this PhD thesis have shown that pre-harvest GABA and MEL treatments increased the yield of lemon trees in both varieties by increasing the number of fruits per tree. In addition, lemon quality parameters such as weight, firmness, total soluble solids (TSS), total acidity (TA) or bioactive compound content were also influenced by the treatments, leading to a delay in the post-harvest ripening of lemons and to a longer period of storage with optimum fruit quality properties for consumption, being the doses of 50 and 100 mM GABA and 0.5 mM MEL the most effective. Regarding post-harvest treatment with MEL at 0.01, 0.1 and 1 mM, the results obtained showed that the most effective dose for prolonging the shelf life of lemon fruit and preserving its quality parameters was 1 mM, mainly maintaining membrane integrity, phenol content and total antioxidant activity after storage at 10 °C for 21 days. It was also observed that the post-harvest application of MEL on leafy lemons was better than on leafless lemons, increasing their shelf life for a longer period of time. The in vivo test with mice treated with lemon juice extracted from fruits previously treated with 10 mM MEL showed that the compound did not present any toxicity or health risk to the animals after consumption, while a lower incidence of oxidative stress and weight gain was observed. Finally, this research has shown that pre- and post-harvest treatments with GABA and MEL, applied at appropriate concentrations, could be considered as a safe strategy, based on natural compounds, to improve crop yield and quality attributes of lemon at the time of harvest and during cold storage. Overall, a solution to a global problem is provided by helping horticultural companies to increase their economic performance by obtaining higher yields and higher quality fruit at all stages from harvest to consumer

Los cítricos, y particularmente los limones, son un grupo de frutos muy apreciados en el mundo entero tanto por su calidad organoléptica y nutricional, como por sus diversos usos tecnológicos, que los convierten en un producto de gran valor para la industria alimentaria. No obstante, si el limón ha ganado relevancia en los últimos años es sin duda debido a su alto contenido en compuestos bioactivos de diversa naturaleza, como el ácido L-ascórbico (comúnmente conocido como vitamina C), las flavanonas, flavonas y ácidos hidroxicinámicos, que han demostrado tener múltiples beneficios para la salud por su fuerte actividad antioxidante. Los cítricos han conquistado todo el mundo y su cultivo está centralizado en torno a los 40º de latitud norte y 40º de latitud sur, lo que nos permite entender por qué el levante mediterráneo es sin duda el lugar estrella para los cítricos en España. De toda la producción hortofrutícola española en 2022, el subsector de los cítricos ocupó el segundo puesto por detrás de las hortalizas en cuanto a cantidad, con un 23% de la producción nacional. En lo que se refiere al fruto del limonero (Citrus limon (L.) Burm. F), España, con una producción de 900.000 toneladas en la campaña 2022/2023, ocupa la tercera posición como productor mundial, y la primera dentro de la Unión Europea. El valor comercial del limón queda fuera de toda duda si tenemos en cuenta que, de esa producción nacional, casi el 70% se exporta fuera de nuestras fronteras, con Alemania como principal importador. Para la comercialización es necesaria la conservación a bajas temperaturas, una de las tecnologías más ampliamente utilizadas para preservar la calidad post-recolección de los frutos. Sin embargo, los frutos de ciertas especies y variedades de cítricos son sensibles a desarrollar daños por frío a temperaturas inferiores a 5 °C, además de ser susceptibles a infecciones fúngicas, factores que deprecian su calidad y comercialización. Todo esto, junto a la creciente preocupación de los consumidores y la limitación por parte de la legislación europea en relación al empleo de fitoquímicos tradicionales, abre nuevas líneas de investigación. Recientemente, se han realizado investigaciones encaminadas a encontrar tratamientos pre y post-recolección con compuestos naturales que sustituyan los tradicionalmente utilizados, para incrementar la calidad de la fruta en el momento de la recolección y mantenerla durante el almacenamiento, debido a las preocupaciones de los consumidores y las restricciones legales sobre el uso de tratamientos químicos tanto antes como después de la recolección. En este sentido, la aplicación de compuestos de origen natural y derivados de las plantas, como tratamientos pre o post-recolección para retrasar la maduración y la senescencia, preservando la calidad de las frutas y hortalizas, ha recibido una atención considerable. Entre estos compuestos el ácido ϒ-aminobutírico (GABA) y la melatonina (MEL) son compuestos que se encuentran ubicuos en las plantas y participan en numerosos procesos fisiológicos de su desarrollo, como en la defensa contra estreses bióticos y abióticos. Es limitada la literatura científica sobre el efecto de la aplicación pre y post- recolección de estos compuestos sobre la calidad del limón. Por tanto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es dar solución a los problemas de calidad del limón mediante tratamientos pre- recolección con GABA y MEL, y tratamientos post- recolección con MEL para resolver principalmente los problemas fisiológicos comunes de dos variedades autóctonas distintas (‘Fino’ injertado sobre Citrus macrophylla y ‘Verna’ injertado sobre Citrus aurantium) en el momento de la recolección, así como sus pérdidas de calidad durante el almacenamiento en frío debidos a la incidencia de daños por frío y/o de infecciones fúngicas, así como a la deshidratación y sobremaduración, con el objetivo final de aumentar su vida útil. Además, se evaluó si los tratamientos tenían efecto sobre la producción total del cultivo. Los tratamientos pre-recolección se realizaron mediante pulverización foliar a las concentraciones de 10, 50 y 100 mM, para el compuesto GABA, en ambas variedades de limón, conteniendo un 0.5 % de Tween 20 como surfactante. En cuanto al compuesto MEL, las concentraciones empleadas en ambos cultivos fueron 0.1, 0.3 y 0.5 mM, también con Tween 20 al 0.5 %. Los tratamientos aplicados después de la recolección de los frutos se dividieron en dos experimentos diferentes. Por un lado, se sumergieron frutos de la variedad Fino, recién recolectados, en disoluciones de melatonina a concentración 0.01, 0.1 y 1 mM. Por otro lado, frutos de limón Verna se sumergieron en melatonina 10 mM para realizar zumo que sería empleado posteriormente en un ensayo in vivo con ratones con el fin de comprobar el efecto del mismo sobre la salud. En todos los experimentos pre-recolección, se evaluó el rendimiento del cultivo en campo y la calidad de los frutos en el momento de la recolección y se realizaron experimentos de conservación a 2 y 10 °C durante 28 días evaluando cada semana, desde el primer día, la calidad organoléptica (color y firmeza), nutritiva [contenido en sólidos solubles totales (SST) y acidez total, (AT)] y funcional [contenido en fenoles totales (CFT) en la piel y en el zumo y actividad antioxidante total (AAT)]. La conservación en frio, también se realizó en el primer experimento post-recolección. Los resultados de esta Tesis Doctoral han demostrado que los tratamientos pre-recolección con GABA y MEL incrementaron el rendimiento de los limoneros en ambas variedades, mediante el aumento del número de frutos por árbol. Además, los parámetros de calidad de los limones, como el peso, la firmeza, los sólidos solubles totales (SST), la acidez total (AT) o el contenido de compuestos bioactivos, también se vieron influenciados por los tratamientos, lo que condujo a un retraso en la maduración post-recolección de los limones y un mayor periodo de conservación de sus propiedades tras el almacenamiento en frio, siendo la dosis de 50 y 100 mM de GABA y 0.5 mM de MEL las más efectivas. Con respecto al tratamiento post- recolección con MEL a 0.01, 0.1 y 1 mM los resultados obtenidos mostraron que la dosis más efectiva para prolongar la vida útil del fruto de limón y preservar sus parámetros de calidad fue 1 mM, manteniendo principalmente la integridad de la membrana, y su contenido en fenoles y actividad antioxidante total tras el almacenamiento a 10 °C durante 21 días. También se observó que la aplicación postcosecha de MEL en limones con hoja fue mejor con respecto a los sin hoja, aumentando su vida útil por más tiempo. El ensayo in vivo con ratones tratados con zumo de limón extraído de frutos previamente tratados con MEL 10 mM mostró como el compuesto no presentaba toxicidad ni riesgo tras su consumo sobre la salud de los animales, mientras redujo la incidencia de estrés oxidativo y ganancia de peso. Finalmente, esta investigación ha demostrado que los tratamientos pre y post- recolección con GABA y MEL, aplicados en las concentraciones adecuadas, podrían considerarse una estrategia segura, basada en compuestos naturales, para mejorar la producción del cultivo, así como los atributos de calidad del limón, en el momento de la recolección y durante el almacenamiento en frio. En general, se aporta una solución a un problema de índole mundial ayudando a las empresas hortícolas a aumentar su rendimiento económico, al obtener mayor producción y frutos con mayores niveles de calidad en todas las etapas, desde la recolección hasta su llegada al consumidor