Direct conversion and microfluidic chambers as tools to study the in-vivo sketch of human sensory neurons

Abstract

Sensory neurons are the primary cells responsible for detecting temperature, mechanical forces, pain, pruritus, and many other somatosensations. These cells, primarily located in the dorsal root ganglia (DRGs) or trigeminal ganglia (TG), exhibit a distinctive morphology, with axons extending up to one meter in length in humans. The cellular and molecular features of sensory neurons, both in physiological and pathological states, are commonly studied in vitro using rodent models, which examine both the cell body and its extensions in the same environment. However, the limited applicability of animal models to the human somatosensory system and the differences between cell bodies and neurites have emerged as significant challenges in sensory neuron research. To address these issues, this work aims to develop a human-based model of sensory neurons through the direct conversion of fibroblasts, a process also known as transdifferentiation. Fibroblasts obtained from foetal lungs, neonatal dermis, or adult dermis were transduced to express Brn3a and Ngn1 using lentiviral vectors. Additionally, the cultured cells were subjected to conversion media containing small molecules that either inhibited or induced intracelular pathways crucial for neuronal development. The effectiveness of the conversion protocols was primarily assessed using calcium imaging, to quantify the functionality of putative induced sensory neurons (iSN). The most promising conversion protocols were further characterized with molecular (qPCR, immunocytochemistry) or functional studies (MEA CMOS, patch clamp). As a result, at least one promising conversion protocol was found for every fibroblast type. Foetal lung fibroblasts presented sensory neurons’ morphology and some neuronal markers after few days of conversion. However, we believe these protocols need to be refined due to their cytotoxicity. Neonatal dermal fibroblasts conversion was more challenging, however finally the addition of the small molecule DAPT seemed to increase the conversion protocol efficiency. However, the same protocol was proven to be inefficient in adult dermal fibroblasts. Therefore, Ascl1 and Brn2 induction was added to the protocol as well as REST inhibition. The addition of these genetic modifications and changing media composition led to a significant increase in the conversion efficiency and in generating putative induced sensory neurons cultured in vitro up to 50 days, which was the end point of our experiment. Importantly, electrophysiological assays should be performed to confirm that the converted cells are functional neurons. Moreover, to recreate the in vivo architecture of sensory neurons, the culture of mouse DRGs in microfluidic chambers (MFC) was optimized. MFCs enabled the physical separation of cell bodies and neurites, allowing for targeted stimulation of terminals and the recording of activity in the cell body. The optimization of this compartmentalized culture allowed to co culture sensory nerve endings with keratinocytes, paving the way to co-culturing with other cell types. Furthermore, nerve endings were treated with inflammatory mediators or a chemotherapeutic agent, demonstrating peripheral sensitization through these agents. This work paves the way to optimizing several conversion protocols and further investigating the already optimized protocol to understand the role of the different components used during the conversion. Moreover, future experiments may be focused on setting up human sensory neurons' compartmentalized culture, which would be a valuable tool for studying human peripheral signalling.

Las neuronas sensoriales son las primeras células responsables de detectar la temperatura, las fuerzas mecánicas, el dolor, el prurito y muchas otras sensaciones. Estas células, localizadas principalmente en los ganglios de la raíz dorsal (DRG por sus siglas en inglés) o en los ganglios trigéminos (TG por sus siglas en inglés), presentan una morfología peculiar, con axones que se extienden hasta un metro de longitud en humanos. Las características celulares y moleculares de las neuronas sensoriales, tanto en estados fisiológicos como patológicos, se estudian comúnmente utilizando modelos de roedores in-vitro, que examinan tanto el cuerpo celular como sus extensiones en el mismo entorno. Sin embargo, la aplicabilidad limitada de los modelos animales al sistema somatosensorial humano y las diferencias entre cuerpos celulares y neuritas presentan desafíos significativos en la investigación de las neuronas sensoriales. Para abordar estos temas, este trabajo tiene como objetivo desarrollar un modelo basado en neuronas sensoriales humanas a través de la conversión directa de fibroblastos, un proceso también conocido como transdifferenciación. Fibroblastos obtenidos de pulmón fetal, dermis neonatal o dermis adulta fueron infectados con vectores lentivirales para expresar Brn3a y Ngn1. Además, las células cultivadas fueron sometidas a medios de conversión que contenían pequeñas moléculas que inhiben o inducen vías intracelulares cruciales para el desarrollo de la cresta neural. La efectividad de los protocolos de conversión se evaluó principalmente utilizando imagen de calcio, para cuantificar la funcionalidad de las neuronas sensoriales inducidas (iSN por sus siglas en inglés) en respuesta a agonistas típicos de neuronas sensoriales. Además, los protocolos de conversión más prometedores se caracterizaron con estudios moleculares (qPCR, inmunocitoquímica) o funcionales (MEA CMOS, patch clamp). Como resultado, se encontró al menos un protocolo de conversión prometedor para cada tipo de fibroblasto. En cuanto a la conversión de fibroblastos pulmonares fetales, después de pocos días de conversión, estas células ya presentaban morfología de neuronas sensoriales y algunos marcadores neuronales. Sin embargo, creemos que estos protocolos necesitan ser refinados debido a la toxicidad en las células convertidas. La conversión de fibroblastos dérmicos neonatales fue más desafiante, pero finalmente la adición de la pequeña molécula DAPT pareció aumentar la eficiencia del protocolo de conversión. Sin embargo, el mismo protocolo demostró ser ineficiente en fibroblastos adultos. Por lo tanto, se decidió inducir la expresión de los factores de transcripción Ascl1 y Brn2, así como la inhibición de REST. La adición de estas modificaciones genéticas y el cambio de la composición de los medios de conversión, llevó a un aumento significativo en la eficiencia del protocolo y a la generación de neuronas sensoriales putativas capaces de sobrevivir hasta 50 días, que fue el punto final de los experimentos. Es importante destacar que todos estos protocolos necesitan ensayos electrofisiológicos para ser caracterizados más profundamente, con el fin de demostrar que las células convertidas son neuronas funcionales. Además, para recrear la morfología que las neuronas sensoriales presentan in vivo, se optimizó el cultivo de DRGs de ratón en cámaras microfluídicas (MFC). Los cultivos compartimentalizados permitieron la separación física de cuerpos celulares y neuritas, permitiendo la estimulación dirigida de los terminales y el registro de la actividad en el cuerpo celular. La optimización de este cultivo permitió co-cultivar terminaciones nerviosas sensoriales con queratinocitos, abriendo el camino al co-cultivo con otros tipos celulares. Además, las terminaciones nerviosas fueron tratadas con mediadores inflamatorios o un agente quimioterapéutico, demostrando sensibilización periférica a través de estos agentes. Este trabajo abre el camino a la optimización de otros protocolos de conversión a través de modificaciones de los protocolos ya optimizados, con el fin de comprender el papel de todos los componentes utilizados durante la conversión. Además, los experimentos futuros pueden centrarse en optimizar el cultivo compartimentalizado de neuronas sensoriales humanas, que sería una herramienta valiosa para estudiar la señalización periférica.