El efecto del IFNα en la autofagia de las células α y β pancreáticas en la diabetes tipo 1

Abstract

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune crónica que representa aproximadamente el 5% de todos los casos de diabetes. Esta patología se caracteriza por la falta casi total de generación de insulina endógena, que ocurre como consecuencia de la destrucción irreversible de aproximadamente el 80% de la masa funcional de células β del páncreas endocrino, provocada por un ataque inmunológico autorreactivo. Se ha establecido que los IFN tipo I (IFN-I), citoquinas que actúan como un vínculo entre los factores genéticos y ambientales que desencadenan la DT1 y que son clave para las respuestas inmunes tanto innatas como adaptativas están implicadas en las primeras etapas de la DT1. Se ha descrito que el IFNα está implicado en la inducción de estrés en el RE, que se ha definido como una de las causas que conduce a la apoptosis de las células β. En este contexto hallazgos recientes indican que el estrés del RE potencia la activación de la autofagia. La autofagia es esencial para mantener la homeostasis de las células β y ha sido identificado como un regulador crítico en la función de estas células tanto en modelos de ratones diabéticos como en pacientes con DT2. Resultados preliminares de nuestro laboratorio muestran una expresión diferencial de genes relacionados con la autofagia en células α y β aisladas de ratón tras el tratamiento con IFNα. En base a estos resultados preliminares, en este Trabajo de Fin de Máster se ha estudiado el papel de la autofagia tras la exposición a IFNα tanto en líneas celulares de células β (MIN-6) como en células α (αTC1-9). Para ello se usaron tratamiento con compuestos moduladores de la autofagia (bafilomicina A1, cloroquina y rapamicina) en combinación con IFNα y, posteriormente, se analizaron proteínas relacionadas con la autofagia (LC3-II y p62) por western blot e inmunofluorescencia y el efecto de la modulación de la autofagia sobre la viabilidad celular. Nuestros resultados sugieren que el IFNα provoca un bloqueo del flujo autofágico en células αTC1- 9, sin embargo, no ejerce un efecto relevante en MIN-6. El ensayo de viabilidad celular indica que la inhibición del flujo autofágico en células α pancreáticas con bafilomicina A1 y cloroquina aumentó la apoptosis, un efecto ligeramente incrementado por la exposición a IFNα. El tratamiento con rapamicina también aumentó la apoptosis, tanto en condiciones basales como con IFNα, pero en menor medida que los inhibidores del flujo autofágico. En células β pancreáticas, la inhibición del flujo autofágico con bafilomicina A1 redujo la viabilidad e indujo apoptosis, mientras que la cloroquina provocó la muerte del 100 % de las células MIN-6, independientemente del tratamiento con IFNα. La rapamicina aumentó ligeramente la apoptosis en condiciones basales, pero con IFNα la disminuyó ligeramente respecto al control.

Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disease that represents approximately 5% of all diabetes cases. This condition is characterized by an almost total lack of endogenous insulin production, which occurs as a result of the irreversible destruction of about 80% of the functional mass of β-cells in the endocrine pancreas due to an autoimmune attack. It has been established that type I interferons (IFN-I), cytokines that act as a link between genetic and environmental factors that trigger T1D and are key to both innate and adaptive immune responses, are involved in the early stages of T1D. IFNα has been implicated in inducing endoplasmic reticulum (ER) stress, which has been identified as a trigger for β-cell apoptosis. In this context, recent findings indicate that ER stress enhances autophagy. Autophagy is essential for β-cell homeostasis and has been identified as a critical regulator of β-cell function in both diabetic mouse models and patients with type 2 diabetes (T2D). Preliminary results from our laboratory show differential expression of autophagy-related genes in α and β-cells from mice after treatment with IFNα. Based on these preliminary results, this TFM studied the role of autophagy after exposure to IFNα in both β-cell lines (MIN-6) and α-cell lines (αTC1-9). For this purpose, treatments with autophagy-modulating compounds (bafilomycin A1, chloroquine, and rapamycin) were used in combination with IFNα, and subsequently, autophagyrelated proteins (LC3-II and p62) were analyzed by western blot and immunofluorescence, as well as the effect of autophagy modulation on cell viability. Our results suggest that IFNα causes a blockage of autophagic flux in αTC1-9 cells; however, it does not have a notable impact on MIN-6 cells. The cell viability assay indicates that inhibition of autophagic flux in pancreatic α-cells with bafilomycin A1 and chloroquine increased apoptosis, an effect slightly enhanced by exposure to IFNα. Treatment with rapamycin also increased apoptosis, both under basal conditions and with IFNα, but not as significantly as autophagic flux inhibitors. In pancreatic β-cells, inhibition of autophagic flux with bafilomycin A1 reduced viability and induced apoptosis, while chloroquine caused 100% death of MIN-6 cells, regardless of IFNα treatment. Rapamycin slightly increased apoptosis under basal conditions but decreased it slightly with IFNα compared to the control.