Obtención de combinaciones cuádruples de alelos mutantes de genes de la familia CUPULIFORMIS de Arabidopsis

Abstract

La familia CUPULIFORMIS (CP) incluye cinco genes, dos de los cuales, INCURVATA11 (ICU11) y CP2, codifican componentes de la maquinaria epigenética de Arabidopsis y son desigualmente redundantes. En este Trabajo de Fin de Grado (TFG) hemos continuado intentos anteriores de establecer si CP3, CP4 y CP5 presentan redundancia funcional, entre sí y/o con ICU11 y CP2. Aunque se habían generado previamente cuádruples mutantes icu11-5 cp3-1 cp4-5 cp5-1 y cp2-3 cp3-1 cp4-5 cp5-1, los alelos cp3-1 y 4-5 podrían no ser nulos. Además, CP4 y CP5 están ligados, lo que dificulta la obtención de dobles mutantes cp4 cp5 mediante cruzamientos, por lo que, previamente al inicio de este TFG se diseñaron dos ARN guía para mutagenizar CP4 mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Hemos obtenidos triples mutantes cp2-1 cp3-2 cp5-1, cp2-1 cp3-2 cp5-2 y cp2-3 cp3-2 cp5-2 y hemos generado una construcción de CRISPR/Cas9 para mutagenizar CP4 y la hemos empleado para transformar células de Agrobacterium tumefaciens.

The CUPULIFORMIS (CP) family includes five genes, two of which, INCURVATA11 (ICU11) and CP2, encode components of the epigenetic machinery of Arabidopsis and are unequally redundant. In this End of Degree Thesis (TFG), we have continued previous attempts to determine whether CP3, CP4, and CP5 exhibit functional redundancy, either among themselves and/or with ICU11 and CP2. Although quadruple mutants icu11 5 cp3-1 cp4-5 cp5-1 and cp2-3 cp3-1 cp4-5 cp5-1 had been previously generated, the cp3-1 and 4-5 alleles may not be null. Additionally, CP4 and CP5 are linked, which complicates obtaining cp4 cp5 double mutants through crossings. Therefore, prior to the start of this TFG, two guide RNAs were designed to mutagenize CP4 using CRISPR/Cas9 technology. We have obtained triple mutants: cp2-1 cp3-2 cp5-1, cp2-1 cp3-2 cp5-2, and cp2-3 cp3-2 cp5-2 and we have generated a CRISPR/Cas9 construct to mutagenize CP4 and used it to transform Agrobacterium tumefaciens cells.