Análisis de la contribución de los genes PRP8, RPS24A y RPS24B al metabolismo del ARN en Arabidopsis thaliana

Abstract

Casi todos los ARN eucarióticos maduran, sufriendo diferentes tipos de cortes exo y endonucleolíticos, la eliminación de algunos de sus segmentos y la sustitución y/o modificación química de determinados ribonucleótidos. Esto es así tanto para los que codifican proteinas (ARN mensajeros [ARNm]) como para los que no las codifican (ARN ribosómicos [ARNr] y otros). Se denomina metabolismo del ARN al conjunto de estos procesos, que se inicia con la síntesis de un transcrito primario y termina con la degradación del ARN maduro, usualmente posterior al cumplimiento de su función. Se denomina pre-ARNm al producto primario de la transcripción de los genes eucarióticos que codifican proteínas, que sufre un complejo proceso de maduración antes de convertirse en un ARNm apto para su exportación desde el núcleo al citoplasma y su traducción por el ribosoma. El splicing de los pre-ARNm es uno de sus mecanismos de maduración mejor conocidos, en el que suceden dos transesterificaciones sucesivas que conllevan la eliminación de un intrón y la ligación de los exones adyacentes. El splicing es realizado por el espliceosoma, una maquinaria ribonucleoproteica compleja, dinámica y muy precisa, que reconoce secuencias conservadas en los extremos de los intrones y exones de los pre-ARNm: los sitios donante (5¿ splicing site; 5¿SS) y aceptor (3¿SS) del splicing. La eliminación de los intrones durante el splicing no siempre es idéntica para todas las moléculas de un mismo pre-ARNm, obteniéndose así diferentes variantes de ARNm maduro, que suelen ser específicas de tejido. Este fenómeno se denomina splicing alternativo y es una de las fuentes principales de la diversificación del proteoma de las plantas, y en particular, de los animales. La proteína ARGONAUTE1 (AGO1) de Arabidopsis thaliana (en adelante, Arabidopsis) es el componente más importante de los RNA-induced silencing complexes (RISC), que juegan un papel central en la regulación postranscripcional de la expresión génica mediada por los microARN (miARN). El alelo ago1-52 del gen AGO1 es hipomorfo, viable y portador de una mutación puntual en su vigésimo intrón, que genera un 3¿SS nuevo, que el espliceosoma usa más frecuentemente que el genuino, que está inalterado. Como resultado, el alelo ago1-52 produce dos ARNm, uno silvestre y muy minoritario, y otro mutante; este último incluye 10 nucleótidos del vigésimo intrón, que desfasan su pauta de lectura. La traducción de este ARNm aberrante rinde una proteína AGO1-52 mutante, que además es mucho más abundante que la proteína AGO1 silvestre en el mutante ago1-52. Los componentes del espliceosoma están muy conservados en todos los eucariotas. Uno de ellos es PRE-MRNA PROCESSING FACTOR 8 (PRP8), una de las proteínas centrales del espliceosoma, que reconoce los 5¿SS y 3¿SS de los intrones de los pre-ARNm. En todas las especies en las que se han estudiado, los alelos nulos de PRP8 son letales, y los hipomorfos causan alteraciones globales del splicing, que a su vez perturban el desarrollo. Hemos caracterizado en esta Tesis seis nuevos alelos mutantes del gen PRP8 de Arabidopsis, que fueron aislados en una búsqueda de supresores extragénicos del fenotipo morfológico de ago1-52. Hemos llamado a estos alelos morphology of argonaute1-52 suppressed 5-1 (mas5-1) a mas5-6. Cuatro de los alelos mas5 del gen PRP8 de Arabidopsis causan sustituciones de uno de los aminoácidos de una región de PRP8 que forma una cavidad próxima al sitio activo de esta proteína. Hemos establecido que la causa de la supresión del fenotipo morfológico del mutante ago1-52 en los dobles mutantes mas5 ago1-52 es la restauración parcial del uso por el espliceosoma del 3¿SS genuino del vigésimo intrón del gen AGO1, que a su vez conlleva una mayor producción del ARNm de AGO1 y la proteína AGO1 silvestres. Del análisis de las bases moleculares de la supresión del fenotipo de ago1-52 y otros mutantes también afectados en el splicing de genes concretos hemos concluido que nuestros alelos mas5 incrementan la fidelidad del splicing, favoreciendo el uso de los 5¿SS y 3¿SS genuinos tras la aparición por mutación de otros nuevos. En consecuencia, en los mutantes mas5 no se altera globalmente el splicing, por lo que crecen como el tipo silvestre o aún mejor. Dado que actualmente es fácil inducir mutaciones mediante CRISPR/Cas, la obtención en líneas celulares de alelos del gen PRP8 humano equivalentes a los mas5 de Arabidopsis podría ser de gran utilidad para el estudio y la eventual terapia de enfermedades causadas por defectos en el splicing de genes concretos, ya que podrían suprimir sus efectos deletéreos sin perturbar globalmente el splicing. El ribosoma citoplásmico 80S (en adelante, el ribosoma) es la maquinaria ribonucleoproteica que traduce a proteínas los ARNm de los genes nucleares. Está constituido por dos subunidades, que contienen cuatro ARNr y decenas de proteínas ribosómicas. La biogénesis del ribosoma es muy compleja y en ella participan tres ARN polimerasas y cientos de proteínas, conocidas colectivamente como factores de la biogénesis del ribosoma, que regulan de forma coordinada la transcripción de los genes del ADN ribosómico (ADNr), la maduración de los ARNr y el ensamblaje del ribosoma. En esta Tesis hemos caracterizado la función de RIBOSOMAL PROTEIN S24A (RPS24A) y RPS24B, una de las cuales está siempre presente, como componente estructural, en la subunidad menor del ribosoma de Arabidopsis. Los genes parálogos RPS24A y RPS24B son casi idénticos. El gen RPS24 humano y el Rps24 de la levadura Saccharomyces cerevisiae son de copia única y codifican una proteína con un papel dual, ya que no solo es un componente estructural del ribosoma sino también un factor de su biogénesis, que actúa en la maduración del ARNr 18S. Hemos caracterizado funcionalmente los genes parálogos RPS24A y RPS24B de Arabidopsis mediante abordajes genéticos y moleculares. Hemos obtenido alelos mutantes de ambos genes, probablemente nulos, y comprobado que su fenotipo morfológico es similar al de los alelos mutantes de genes implicados en la maquinaria de la traducción. Hemos concluido, tras intentar obtener dobles mutantes rps24a rps24b, que Arabidopsis necesita al menos dos copias silvestres de alguno de sus dos genes RPS24 para su viabilidad, y tres para su desarrollo normal. Estos resultados indican que RPS24A y RPS24B presentan haploinsuficiencia combinada; RPS24, su ortólogo humano, es de copia única y haploinsuficiente. Nuestro estudio de los mutantes rps24a y rps24b ha revelado defectos en la maduración de sus ARNr: en estas estirpes se acumulan precursores del ARNr 18S y está incrementada la transcripción del ADNr 45S, que codifica los tres ARNr mayores (25S, 18S y 5,8S). Estos resultados sugieren funciones extrarribosómicas de RPS24A y RPS24B, en el procesamiento del pre-ARNr 45S y en la represión de la transcripción del ADNr 45S. Hemos observado fenotipos morfológicos y moleculares sinérgicos en las combinaciones dobles de rps24b con alelos mutantes de genes que codifican otros factores de la biogénesis del ribosoma. Hemos demostrado que RPS24A y RPS24B no solo juegan un papel estructural en el ribosoma, sino que actúan también como factores de la biogénesis del ribosoma, tal como hacen sus ortólogos humano y de la levadura.