Small extracellular vesicles as a potential clinical tool for hard-to-treat cancer therapy

Abstract

Hard-to-treat cancers such as glioblastoma (GBM) and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), are characterized by their aggressive nature and resistance to conventional therapies. Despite the standard of care, which includes tumor resection followed by chemotherapy and radiotherapy, patients have a poor prognosis. Therefore, the development of novel therapeutic approaches is necessary. In this sense, the use of small extracellular vesicles (EVs) as delivery systems has become a promising tool for cancer treatment. This system can deliver anticancer drugs directly to tumor cells, improving the efficacy of treatment. In this work, we used small EVs loaded with different drugs to prove their target specificity towards their parental cells and evaluate their potential as an effective treatment for cancer. In addition, we studied the PADI4 interactome and citrullination capacity, its relationship with cancer progression, and its role as a target for cancer therapy. This doctoral thesis is structured as a compendium of six articles published in high-impact journals (Q1) that correspond to each chapter, with an additional chapter of the data pending publication. In Chapter 1, we discussed how small EVs play a crucial role in intercellular communication and have emerged as potential biomarkers and therapeutic tools, particularly in cancer. Additionally, we reviewed the significance of small EVs as biomarkers in various cancer types. Furthermore, we explored the development of chimeric EVs that can be conjugated with nanoparticles, biomolecules, and anti-cancer drugs, showing their potential for targeted cancer therapy. The review also provides an overview of ongoing clinical trials utilizing EVs to improve the prognosis of different cancer types, emphasizing the potential of EV-based therapies to combat these challenging diseases. In Chapter 2, we performed the isolation and characterization of small EVs derived from GBM patient cell lines. We loaded these EVs with temozolomide (TMZ) and EPZ015666 drugs and observed that a minimal amount of the drug is sufficient to affect tumor cells when it is loaded into small EVs. Additionally, GBM-derived small EVs loaded with the drugs showed the potential to induce an antiproliferative effect in pancreatic cancer cells. These findings support the use of GBM-derived small EVs as a promising drug delivery tool for further preclinical and clinical development of GBM treatments. In Chapter 3, we isolated and characterized small EVs derived from a PDAC cell line named RWP-1. We loaded these small EVs with two chemotherapeutic drugs, TMZ and EPZ015666 by the direct incubation method, which proved to be the most effective loading method, requiring minimal drug dosage to affect tumor cells. The antiproliferative effect was tested on different cancer cell lines, revealing greater efficacy of RWP-1 small EVsTMZ compared to RWP-1 small EVsEPZ015666. These findings highlight the potential of RWP-1-derived small EVs as a promising drug delivery tool for PDAC treatment. In Chapter 4, we identified the expression and localization of PADI4, a Ca2+-dependent protein involved in the conversion of arginine to citrulline, in several cancer cell lines, including GBM (GB-39), and pancreatic cancer (RWP-1). Additionally, we studied its relationship with p53. The characterization by immunofluorescence (IF) revealed different subcellular localizations of PADI4 depending on the cancer cell line. In the Westen Blot (WB) we observed different patterns of protein, revealing the possibility that PADI4 might experience alternative splicing. These findings shed light on the functional role of PADI4 in cancer development. In Chapter 5, we performed WB to identify the expression of PADI4 in GBM cell lines. Additionally, we investigated if GSK484, a well-known PADI4 inhibitor, could have an effect on GBM and PDAC cell proliferation. Finally, we tested if GSK484 loaded into small EVs had a higher effect on cell proliferation than the administration of the drug alone. Our results indicated that PADI4 expression was different among several cancer cell lines. Besides, GSK484 effectively decreases the proliferation of GBM and PDAC cell lines when it was loaded into small EVs, with a minimum concentration of the drug. In Chapter 6, we analyzed the interaction between NUPR1 and PADI4 in GBM cell lines. In vitro and in cellulo experiments revealed a strong binding affinity between NUPR1 and PADI4 in the nucleus, suggesting that the NUPR1/PADI4 complex may be essential in DNA repair, metastasis promotion, or citrullination of other proteins. These results highlight the importance of their interaction and their role as a potential target for cancer therapy. Finally, in Chapter 7, we identified the interaction between PADI4 and MDM2. In this work, the PADI4/MDM2 complex was found in the nucleus and cytoplasm of different cancer cell lines. Additionally, we found that their treatment with GSK484 impeded the nuclear binding of these two proteins, suggesting that MDM2 binds to the active site of PADI4. The interaction between MDM2 and PADI4 may lead to MDM2 citrullination, which could be a therapeutic target for cancer treatment. This Thesis revealed the potential use of small EVs derived from hard-to-treat cancer cells as a novel therapeutic approach for the treatment of GBM and PDAC. By loading these EVs with therapeutic drugs, such as TMZ, EPZ015666, and GSK484, we enhanced the drug delivery efficiency, which could reduce the side effects associated with conventional therapies. Furthermore, we explored the role of PADI4 in GBM and PDAC. By elucidating the interactions between PADI4 and its partners, we uncovered potential mechanisms involved in cancer progression and identified new avenues for targeted therapies. This work settles the basis of future personalized medical approaches and provides valuable insights into EVs biology to develop innovative strategies for the treatment of GBM and PDAC based on them as drug delivery systems.

Los cánceres difíciles de tratar, como el glioblastoma (GBM) y el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), se caracterizan por su agresividad y su resistencia a las terapias convencionales. A pesar del tratamiento estándar, que incluye la resección del tumor seguida de quimioterapia y radioterapia, los pacientes tienen un mal pronóstico. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. En este sentido, el uso de vesículas extracelulares pequeñas como sistemas de administración se ha convertido en una herramienta prometedora para el tratamiento del cáncer. Este sistema puede administrar fármacos anticancerígenos directamente a las células tumorales, mejorando la eficacia del tratamiento. En este trabajo, utilizamos pequeñas vesículas extracelulares cargadas con fármacos para inverstigar su especificidad sobre sus células progenitoras y, si son adecuadas para el tratamiento del cáncer. Además, estudiamos el interactoma de PADI4 y su capacidad de citrulinación, su relación con la progresión del cáncer y su papel como diana para la terapia del cáncer. La presente tesis doctoral, se estructura como un compendio de seis artículos publicados en revistas de alto impacto (Q1) que se corresponden con cada capítulo y, un capítulo de datos pendientes de publicación. En el Capítulo 1, analizamos cómo las EVs desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular y han surgido como posibles biomarcadores y herramientas terapéuticas, especialmente en el cáncer. Además, revisamos la importancia de las EVs como biomarcadores en varios tipos de cáncer. Exploramos igualmente el desarrollo de EVs quiméricas que pueden conjugarse con nanopartículas, biomoléculas y fármacos contra el cáncer, mostrando su potencial para la terapia dirigida del cáncer. La revisión también ofrece una visión general de los ensayos clínicos en curso que utilizan EVs para mejorar el pronóstico de diferentes tipos de cáncer, haciendo hincapié en el potencial de las terapias basadas en EV para combatir estas enfermedades difíciles de tratar. En el Capítulo 2, realizamos el aislamiento y la caracterización de EVs derivadas de líneas celulares de pacientes con GBM. Cargamos estas EVs con los fármacos temozolomida (TMZ) y EPZ015666 y observamos que una cantidad mínima del fármaco es suficiente para afectar a las células tumorales cuando se carga en EVs. Además, las EVs derivadas de GBM cargadas con los fármacos mostraron potencial para inducir un efecto antiproliferativo en células de cáncer de páncreas. Estos resultados apoyan el uso de EVs derivadas de GBM como una prometedora herramienta de administración de fármacos para el desarrollo preclínico y clínico de tratamientos contra el GBM. En el Capítulo 3, aislamos y caracterizamos EVs derivadas de una línea celular de PDAC denominada RWP-1. Cargamos estas EVs con dos fármacos quimioterapéuticos, TMZ y EPZ015666 mediante el método de incubación directa, que demostró ser el método de carga más eficaz, requiriendo una dosis mínima de fármaco para afectar a las células tumorales. El efecto antiproliferativo se probó en diferentes líneas celulares de cáncer, revelando una mayor eficacia de RWP-1 small EVsTMZ en comparación con RWP-1 small EVsEPZ015666. Estos resultados ponen de manifiesto el potencial de las EVs derivadas de RWP-1 como un sistema prometedor de administración de fármacos para el tratamiento del PDAC. En el Capítulo 4, identificamos la expresión y localización de PADI4, una proteína dependiente de Ca2+ implicada en la conversión de arginina en citrulina, en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo GBM (GB-39), y cáncer de páncreas (RWP-1). Además, estudiamos su relación con p53. La caracterización mediante inmunofluorescencia (IF) reveló diferentes localizaciones subcelulares de PADI4 en función de la línea celular. En el Westen Blot (WB) observamos diferentes patrones de la proteína, revelando la posibilidad de que PADI4 pudiera experimentar splicing alternativo. Estos hallazgos arrojan luz sobre el papel funcional de PADI4 en el desarrollo del cáncer. En el Capítulo 5, identificamos la expresión de PADI4 en líneas celulares de GBM mediante WB. Además, investigamos si GSK484, un conocido inhibidor de PADI4, podría tener un efecto sobre la proliferación de células de GBM y PDAC. Por último, probamos si GSK484 cargado en EVs tenía un mayor efecto sobre la proliferación celular que la administración del fármaco solo. Nuestros resultados indicaron que la expresión de PADI4 era diferente entre varias líneas celulares cancerosas. Además, GSK484 disminuyó eficazmente la proliferación de las líneas celulares de GBM y PDAC cuando se cargó en EVs, con una concentración mínima del fármaco. En el Capítulo 6, analizamos la interacción entre NUPR1 y PADI4 en líneas celulares de GBM. Los experimentos in vitro e in cellulo revelaron una fuerte afinidad de unión entre NUPR1 y PADI4 en el núcleo, lo que sugiere que el complejo NUPR1/PADI4 puede ser esencial en la reparación del ADN, la promoción de metástasis o la citrulinación de otras proteínas. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de su interacción y su papel como posible diana para la terapia del cáncer. Por último, en el Capítulo 7, identificamos la interacción entre PADI4 y MDM2. En este trabajo, el complejo PADI4/MDM2 se encontró en el núcleo y en el citoplasma de diferentes líneas celulares de cáncer. Además, el tratamiento con GSK484 impidió la unión de estas dos proteínas, lo que sugiere que MDM2 se une al sitio activo de PADI4. La interacción entre MDM2 y PADI4 puede conducir a la citrulinación de MDM2, que podría ser una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. Esta tesis ha expuesto el uso potencial de las EVs derivadas de células cancerosas de tumores difíciles de tratar como un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de GBM y PDAC. Al cargar estas EVs con fármacos terapéuticos, como TMZ, EPZ015666 y GSK484, mejoramos la eficiencia de administración del fármaco, lo que podría reducir los efectos secundarios asociados a las terapias convencionales. Además, exploramos el papel de PADI4 en GBM y PDAC. Al dilucidar las interacciones entre PADI4 y otras proteínas, descubrimos posibles mecanismos implicados en la progresión del cáncer e identificamos nuevas vías para el desarrollo de terapias dirigidas. Este trabajo sienta las bases de futuros enfoques médicos personalizados y proporciona información valiosa sobre la biología de las EVs para desarrollar estrategias innovadoras en el tratamiento de GBM y PDAC basadas en estas como sistemas de administración de fármacos.