Deciphering apolipoprotein E-associated alterations in Alzheimer’s Disease

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is an age-related neurodegenerative disorder and the main cause of dementia, characterised by two specific pathological hallmarks: the extracellular deposition of neurotoxic amyloid beta peptides in the form of senile plaques, and the intracellular accumulation of hyperphosphorylated forms of the cytoskeletal protein tau in neurofibrillary tangles. Two forms of AD exist, early-onset AD, which occurs before the age of 65 years and is usually hereditary; and late-onset, or sporadic AD (sAD), which accounts for more than 95% of cases and is linked to a series of genetic and environmental risk factors. APOE, the gene encoding the apolipoprotein E (apoE) protein, is the most prominent genetic risk factor for sAD. Three allelic variants exist in humans: APOE ε2, the least common variant linked to a reduced risk of developing AD; APOE ε3, the most common variant considered to be risk-neutral; and APOE ε4, linked to an increased risk of AD. The isoforms encoded by the allelic variants differ in single amino acid substitutions at positions 112 or 158; with apoE4 presenting Arginine at both positions, thus being unable to form disulphide-linked dimers, the most effective form of apoE to interact with cellular receptors. ApoE is the most important cholesterol transporter in the brain, however it has many other functions, some of which are dependent on its interactions with receptors, including apoER2, the main ligand of which is reelin. Reelin is a large glycoprotein that regulates neuronal migration during brain development, and is implicated in synaptic transmission, plasticity, and memory in the adult brain. In this doctoral thesis, we aimed to characterise altered patterns of apoE and reelin proteins in the cerebrospinal fluid (CSF) of AD patients, and to describe a relatively unknown apoE receptor, LRP3, and determine how it interacts with key proteins in AD. An imbalance of apoE glycoforms, with an increased abundance of immatures species, was detected in AD samples compared to controls, alongside the appearance, exclusively in AD samples, of an aberrant high molecular mass species that was compatible with dimers but resistant to reducing agents. ApoE4 also participates in these aberrant dimers, despite the inability of these isoforms to form disulphide-linked dimers. The apoE glycoform imbalance was replicated in AD brain samples. Full-length reelin levels decreased in AD CSF and presented a different profile of fragments, characterized by increased C-terminal region cleavage and decreased N-terminal region cleavage, as compared with control subjects. Once again, aberrant complexes of high molecular mass, composed mainly of N-terminal reelin fragments, were also detected in AD, regardless of the APOE genotype. Regarding LRP3, we found a reduced presence of the receptor in the brain of AD patients and discovered that the expression of LRP3 is modulated by apoER2; and that LRP3 can in turn influence APP and Aβ levels. These results indicate a possible pathological situation in which modifications of the apoE and reelin proteins affect their protective functions and the efficiency of apoER2 signalling, thus contributing to the exacerbation of AD. These modifications can also affect mechanisms of co-regulation of key AD proteins, such as APP, thus implicating the LRP3 receptor. The apoE glycoform imbalance and the fragmentation profile of reelin, alongside the appearance of aberrant aggregates of both proteins, could serve as potential read-outs of impaired signalling, and may also have potential for AD diagnosis and progression.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo asociado a la edad y la principal causa de demencia. Se caracteriza por dos rasgos patológicos principales: el depósito extracelular de péptidos neurotóxicos de beta amiloide en forma de placas seniles, y la acumulación intracelular de formas hiperfosforiladas de la proteína citoesquelética tau en ovillos neurofibrilares. Existen dos formas de EA: EA de inicio temprano (antes de los 65 años), que suele ser hereditaria, y EA de inicio tardío o esporádica, que representa más del 95% de casos y se asocia a factores de riesgo genéticos y ambientales. APOE, el gen que codifica la apolipoproteína E (apoE), es el factor de riesgo genético más importante para sAD. Existen tres variantes alélicas en humanos: APOE ε2, la menos frecuente y relacionada con un riesgo reducido de desarrollar EA; APOE ε3, la más común y neutra; y APOE ε4, relacionada con un mayor riesgo de padecer EA. Las isoformas codificadas por las variantes alélicas difieren en sustituciones de un aminoácido en las posiciones 112 o 158; y apoE4 presenta arginina en ambas posiciones, por lo que no puede formar dímeros por enlaces disulfuro, la forma más efectiva en la interacción con receptores celulares. ApoE es el transportador de colesterol más importante en el cerebro, pero tiene otras funciones, algunas asociadas a su interacción con receptores, como el apoER2, cuyo ligando principal es la reelina. La reelina es una glicoproteína involucrada en la migración neuronal durante el neurodesarrollo, y en el cerebro adulto participa en la memoria, y en la transmisión y plasticidad sináptica. En esta tesis doctoral, nuestro objetivo fue caracterizar los patrones alterados de las proteínas apoE y reelina en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EA, y describir la función de un receptor de apoE, LRP3, apenas caracterizado en el SNC. Encontramos un desbalance de las glicoformas de apoE, con una mayor abundancia de especies inmaduras en las muestras de LCR con EA, en comparación con los controles. También detectamos la aparición, exclusivamente en EA, de una especie aberrante de alto peso molecular, compatible con los dímeros pero resistente a agentes reductores. El apoE4 también participa en estos dímeros aberrantes, a pesar de su incapacidad de formar dímeros por enlaces disulfuro. El desequilibrio de glicoformas de apoE se replicó en muestras de cerebro con EA. Los niveles de reelina, como proteína completa, sin procesar proteolíticamente, disminuyeron en el LCR de EA y presentaron un perfil alterado de fragmentos, debido a un aumento de fragmentación en la región C-terminal y una disminución en la región N-terminal, en comparación con los controles. Detectamos complejos aberrantes de 500 kDa compuestos principalmente por fragmentos N-terminales de reelina, independientemente del genotipo APOE. En cuanto a LRP3, detectamos niveles reducidos del receptor en el cerebro de pacientes con EA y descubrimos que la expresión de LRP3 está modulada por apoER2; y que LRP3 puede a su vez influir en los niveles de APP y del péptido beta amiloide a través de mecanismos de endocitosis. Estos resultados indican que modificaciones de las proteínas apoE y reelina podrían afectar a sus funciones protectoras y a la eficiencia de la señalización de apoER2, contribuyendo así a la exacerbación de la EA. Estas alteraciones pueden también afectar la co-regulación de proteínas claves en la EA, como APP, a través del receptor LRP3. El desequilibrio de las glicoformas de apoE y el perfil de fragmentación de reelina, junto con la aparición de agregados aberrantes de ambas proteínas, podrían servir como indicadores de señalización alterada y tener un uso potencial para el diagnóstico de la EA.