Investigating chemotherapy-induced peripheral neuropathies and its sexual dimorphism using an in vitro preclinical pain model

Abstract

El dolor crónico es uno de los problemas de salud con mayor incidencia en la sociedad actual. En el caso de los pacientes con cáncer, el dolor producido por los tratamientos quimioterapéuticos es tan severo que se considera uno de los principales efectos adversos por el cual deben reducir o incluso interrumpir su tratamiento, comprometiendo la supervivencia y la calidad de vida de estos pacientes. Este dolor se desencadena como consecuencia de la neuropatía periférica inducida por la quimioterapia (CIPN). Gracias a numerosos estudios realizados a nivel preclínico y clínico, se sabe que el origen de estas neuropatías se debe a la alteración que generan los tratamientos quimioterapéuticos sobre la actividad de las neuronas del sistema nervioso periférico encargadas del envío de señales nocivas, conocidas como nociceptores. Sin embargo, se desconocen los mecanismos exactos que alteran la funcionalidad en estos nociceptores desencadenando la generación y mantenimiento de este dolor. Debido a esta falta de conocimiento, actualmente no existe ningún tratamiento efectivo aprobado para aliviar estos síntomas. Ante esta situación, se diseñó la presente tesis doctoral con el objetivo de investigar los mecanismos funcionales y moleculares implicados en la sensibilización producida por dos de los quimioterapéuticos prescritos con mayor frecuencia: paclitaxel y oxaliplatino. El primer objetivo consistió en desarrollar un modelo preclínico con el que poder estudiar exposiciones prolongadas a quimioterapéuticos y estudiar el curso temporal de sus efectos neurotóxicos. Para ello, se estableció y caracterizó un cultivo celular in vitro con viabilidad de hasta 10 días a partir de DRG provenientes de ratas adultas. Posteriormente, se investigó el efecto de la exposición directa del paclitaxel y oxaliplatino sobre los nociceptores en cultivo. Usando este modelo de neuropatía inducida por paclitaxel, observamos un incremento en la excitabilidad de los nociceptores alcanzando un máximo de actividad a las 48 h después del tratamiento, el cual se revierte en ausencia prolongada del quimioterapéutico. Estos datos reproducen los resultados publicados previamente en estudios clínicos y muestran el potencial traslacional de este modelo para el estudio de estas neuropatías. Gracias a estos cultivos longevos de DRG, pudimos observar que el aumento de la actividad se produjo tanto en las neuronas IB4(-) como IB4(+). Además, este se correlacionó con una mayor funcionalidad de los canales iónicos NaV1.8, TRPV1 y TRPM8, postulando estos canales iónicos como potenciales dianas terapéuticas para tratar la CIPN. Sin embargo, cuando analizamos los niveles de ARNm de estos canales, no se detectaron diferencias significativas, indicando que la desregulación de estos canales estaría ocurriendo mediante mecanismos postraduccionales en vez de postranscripcionales. Además, debido al creciente número de evidencias sobre la existencia de dimorfismo sexual en la sintomatología y las vías fisiopatológicas del dolor, se estableció como objetivo a su vez analizar estas posibles diferencias examinando por separado cultivos obtenidos de ratas macho y hembra. Con esta segregación, pudimos encontrar que las hembras eran más sensibles al efecto del paclitaxel, encontrando un aumento más pronunciado en la excitabilidad de sus nociceptores tras el tratamiento. En el caso del modelo de neuropatía inducida por oxaliplatino, se observó un efecto dependiente del tiempo de exposición, en el cual duraciones de exposición más largas (48 h comparado con 24 h) produjeron la sensibilización de las neuronas. Inmediatamente después del tratamiento de 48 h, se observó un aumento de la excitabilidad de las neuronas. Este aumento estaba producido principalmente por el subtipo neuronal IB4(+), en el que se encontró una reducción significativa en la reobase y un aumento de la frecuencia de disparo de potenciales de acción. En relación con este efecto, pudimos observar una alteración en la cinética de los canales iónicos NaV, enlenteciendo su inactivación y agilizando la recuperación frente a la inactivación. Analizando la corriente mediada por los canales iónicos TRP, encontramos un aumento en las corrientes mediadas por TRPV1 y TRPA1, mientras que las producidas por activación del canal iónico TRPM8 se mantuvieron inalteradas. Mediante PCR cuantitativa detectamos que el oxaliplatino producía un aumento en la expresión del ARNm de TRPV1 y TRPA1, sugiriendo una sobreexpresión de estos canales iónicos en las neuronas como posible mecanismo para explicar el incremento en la excitabilidad de las IB4(+). Sin embargo, estas respuestas al tratamiento con oxaliplatino no ocurrieron igual en los cultivos procedentes de ambos sexos. De hecho, el oxaliplatino sólo despolarizó el potencial de membrana de las neuronas extraídas de cultivos de ratas hembra. Además, se encontraron diferencias significativas en los mecanismos moleculares subyacentes. Las hembras presentaron una reducción de la densidad de corriente mediada por los canales KV y un aumento de la producida por los canales NaV, mientras que los machos presentaron una mayor duración de la corriente de los NaV y una recuperación más rápida tras su inactivación, pero menor densidad de corriente mediada por estos canales. A su vez, los machos presentaron un porcentaje mayor de neuronas que respondieron al agonista específico de TRPA1, sugiriendo una mayor desregulación en los niveles del canal TRPA1 en este sexo inmediatamente después del tratamiento con oxaliplatino. De esta forma, los datos obtenidos con ambos modelos sugerían que el dimorfismo sexual podría tener una gran influencia en la CIPN. Además, los canales TRP parecían jugar un papel relevante en estas diferencias. Para explorar este tema con mayor profundidad, realizamos una revisión sobre los estudios que abordaron el papel de los canales termoTRP en machos y hembras con dolor crónico con un fuerte componente periférico: migraña crónica y CIPN. Una de las conclusiones de este trabajo fue la necesidad de incorporar y segregar ambos sexos en los ensayos clínicos y preclínicos, ya que en muchos de ellos no se analizaron por separado y, cada vez, más evidencias apuntan hacia la presencia de dimorfismo sexual en las vías de señalización del dolor. Valorando las opciones terapéuticas, destacamos la posibilidad de modular estos canales mediante el desarrollo de formulaciones tópicas adaptadas al sexo del individuo, ya que permitirían minimizar la aparición de posibles efectos adversos. Pero, para lograr la eficacia de estos tratamientos en toda la población, surge la necesidad de seguir investigando para comprender los mecanismos moleculares que expliquen este dimorfismo sexual. Sólo a través de este conocimiento se podrán desarrollar y adaptar los fármacos para que sean más efectivos en hombres y mujeres, consiguiendo un tratamiento satisfactorio y personalizado frente al dolor crónico. En conclusión, en esta tesis doctoral se han desarrollado dos modelos in vitro preclínicos que emulan la neuropatía inducida por los agentes quimioterapéuticos paclitaxel y oxaliplatino. Con estos modelos, hemos podido replicar resultados publicados anteriormente en ensayos clínicos mostrando su potencial para estudiar las neuropatías periféricas. Además, hemos podido identificar posibles dianas terapéuticas para tratar el dolor crónico producido por el tratamiento con oxaliplatino y paclitaxel. Por último, esta tesis muestra la novedosa presencia de dimorfismo sexual en la respuesta a estos agentes y abre una nueva vía para realizar tratamientos dirigidos frente a la CIPN.

Chronic pain is one of the health problems with a stronger incidence in society. In the case of cancer patients, the pain evoked by chemotherapeutic agents can be so severe that it is considered one of the major adverse effects by which they have to reduce or even stop their treatment, compromising the survival and quality of life of these patients. This pain evolves as a consequence of the peripheral neuropathy induced by the chemotherapy (CIPN). Thanks to numerous studies performed at clinical and preclinical levels, it is well-known that this neuropathy is produced by the alteration of the activity of the neurons of the peripheral nervous system responsible of sending noxious signals, known as nociceptors. Nevertheless, the exact mechanisms underlying the generation and maintenance of the pain symptoms remain unknown. Due to this lack of knowledge, nowadays there is no effective treatment approved for alleviating this pain. To address this issue, the present doctoral thesis was designed with the aim of investigating the functional and molecular mechanisms implicated in the sensitization produced by two of the most common chemotherapeutic agents: paclitaxel and oxaliplatin. The first objective consisted of developing a preclinical in vitro model that allowed to investigate prolonged exposures of sensory neurons to chemotherapeutic agents and studying the time course of the algesic effect. For this task, we established and characterized a long-term cell culture of rat DRG nociceptors that could survive up to 10 days in vitro. Then, the effects of the direct exposure to paclitaxel and oxaliplatin on the cultured nociceptors were investigated. As a result of the model of paclitaxel-induced neuropathy, we observed a reversible sensitization in the activity of the neurons that peaked 48 h after eliminating the treatment, virtually dissipating following prolonged absence of the chemotherapeutic. These data reproduced the results published in previous clinical trials, suggesting the translational potential of the model. Thanks to these long-term cultures, we could observe that the increase in the activity was present in both IB4(-) and IB4(+) neurons. In addition, this effect was correlated with a higher activity of the ion channels TRPV1, TRPM8, and NaV1.8, emerging as potential therapeutic targets to treat the CIPN. However, when we analyzed the mRNA levels of these channels, we could not detect significant differences, indicating that the channels dysregulation was occurring by post-translational rather than transcriptional mechanisms. Besides, due to the cumulative evidence on the existence of sexual dimorphism in the symptomatology and physiopathological pathways of pain, an additional objective was established to analyze the possible sex differences examining separately the cultures obtained from male and female rats. With this segregation, we could find that females were more sensitive to paclitaxel, showing a more pronounced increase in the nociceptors’ excitability after its treatment. For the model of oxaliplatin-induced neuropathy, oxaliplatin produced a time-dependent effect, with longer incubation times (48 h compared with 24 h exposure) driving to a higher sensitization of the neurons. Immediately after the 48 h treatment, the sensory neurons exhibited a notorious increase in the excitability. This increase was mainly produced in the IB4(+) neuronal subtype, where we could detect a reduced rheobase and a higher firing frequency of action potentials. Related to this effect, we observed an alteration in the kinetics of the NaV channels, slowing down their inactivation and promoting the recovery from their fast inactivation. Analyzing TRP channels, enhanced activity of TRPV1 and TRPA1 channels was detected without affecting TRPM8 functionality. As a possible explanatory mechanism, using quantitative PCR, we found higher TRPV1 and TRPA1 mRNA levels, suggesting that oxaliplatin could modify these channels by transcriptional mechanisms. Interestingly, the response to oxaliplatin showed a sexual dimorphic effect. Oxaliplatin only depolarized the resting membrane potential of the neurons extracted from female rats. Moreover, significant sex differences were found in the underlying molecular mechanisms. Females showed increased NaV and diminished KV current density, whereas males presented bigger expression of the TRPA1 ion channel and longer duration and faster recovery of the NaV current. In this way, the data obtained with both models suggested that the sexual dimorphism could have a strong influence in CIPN. Besides, TRP channels seemed to play a pivotal role in these differences. To further explore this topic, we conducted a review on the role of thermoTRP channels in males and females in two types of chronic pain with a strong peripheral component: chronic migraine and CIPN. One of the conclusions that we could extract from this work was the need of incorporating and segregating both sexes in clinical and preclinical assays, because most of these studies did not analyze them separately and, nowadays, an increasing number of evidence points towards the presence of sexual dimorphism in pain pathways. Studying the different therapeutic options available, we remarked the possibility of modulating these channels with topical formulations, due to the lower associated adverse effects. However, to achieve the effectiveness of these treatments in the whole population, there is a need of continue investigating the molecular details that could explain this sexual dimorphism. Only from this knowledge we could develop and adapt more effective pharmacological drugs for men and women, reaching a satisfactory treatment against chronic pain. Taken together, in this doctoral thesis we have developed two in vitro preclinical models that emulated the neuropathy induced by the chemotherapeutic agents’ paclitaxel and oxaliplatin. With these in vitro models, we could replicate previous data obtained in clinical and preclinical assays, showing its translational potential for investigating the peripheral neuropathies. Besides, we could identify potential therapeutic targets for treating the chronic pain produced by paclitaxel and oxaliplatin treatments. Finally, the present doctoral thesis shows the novel presence of sexual dimorphism in response to these agents opening a new venue to develop personalized treatments against CIPN.