Análisis funcional de RRP8 y desarrollo de un método basado en la PCR digital para el análisis del número de copias del ADNr 45S

Abstract

La biogénesis del ribosoma es un proceso esencial y complejo que tiene lugar de manera altamente regulada en todas las células de cualquier organismo vivo. Ribosomal RNA Processing 8 (Rrp8p) es una metiltransferasa de ARN ribosómico en la levadura y en humanos. Con este Trabajo de Fin de Máster hemos contribuido a la caracterización de RRP8 en Arabidopsis. Hemos predicho in silico la función y localización suborganular de RRP8, hemos confirmado el alelismo de rrp8-1 y rrp8-2, dos alelos insercionales que interrumpen el gen RRP8, hemos contribuido a la caracterización de líneas transgénicas para la sobreexpresión de RRP8 y el rescate de sus alelos mutantes y hemos iniciado la construcción de un transgén para establecer la localización subcelular de la proteína RRP8. Hemos obtenido dobles mutantes entre los mutantes rrp8 y otros mutantes de pérdida de función en genes involucrados en la biogénesis del ribosoma. Hemos analizado también la expresión del ADNr 45S en los mutantes rrp8 y en otros mutantes afectados en genes implicados en la biogénesis del ribosoma. Por otro lado, hemos desarrollado un método basado en la PCR digital (dPCR) para estimar el número de copias del ADNr 45S presente en estirpes silvestres y mutantes, utilizando los mutantes fas1 como control, ya que contiene menos copias de este gen que sus ancestros silvestres.

Ribosome biogenesis is an essential and complex process that occurs in a highly regulated manner in all cells of any living organism. Ribosomal RNA Processing 8 (Rrp8p) is a ribosomal RNA methyltransferase in yeast and humans. With this Master's thesis we have contributed to the characterization of RRP8 in Arabidopsis. We have predicted in silico the function and suborganular localization of RRP8, confirmed the allelism of rrp8-1 and rrp8-2, two insertional alleles that disrupt the RRP8 gene, contributed to the characterization of transgenic lines for RRP8 overexpression and the rescue of its mutant alleles, and initiated the construction of a subcellular localization transgene of the RRP8 protein. We have obtained double mutants between rrp8 mutants and other loss-of-function mutants in genes involved in ribosome biogenesis. We have also analyzed 45S rDNA expression in rrp8 mutants and other mutants affected in genes involved in ribosome biogenesis. On the other hand, we have developed a method based on digital PCR (dPCR) to estimate the copy number of 45S rDNA present in several wild-type accessions and in mutant strains, using the fas1 mutants as control, since they have a reduction in the number of copies of this gene respect to their wild-type backgrounds.