In vitro methods of biopharmaceutical evaluation in the blood-brain barrier

Abstract

El acceso y la distribución de fármacos en el sistema nervioso central (SNC) es uno de los pasos limitantes a la hora de tratar patologías que afectan tanto al cerebro como a la médula espinal por la presencia de la barrera hematoencefálica (BHE). Además, la prevalencia de estas patologías aumenta año tras año en todo el mundo y la mayoría de los ensayos clínicos que se realizan con nuevas moléculas para tratarlas fracasan tras una gran inversión de dinero.

Así, en esta tesis, se ha optimizado la metodología in vitro para la determinación de la permeabilidad de la BHE, se han obtenido varias correlaciones in vitro/in vivo (IVIVCs) que pueden relacionar los resultados obtenidos mediante la metodología in vitro con datos in vivo procedentes de ratas, se ha desarrollado un nuevo modelo matemático que es capaz de predecir la distribución de fármacos en el cerebro y se han conseguido dos nuevas nanoestructuras que aumentan el acceso de ponatinib al SNC.

Primero, se optimizó un modelo de BHE propuesto previamente, en el que se utilizaban dos monocapas celulares diferentes (MDCK y MDCK-MDR1) para simular la barrera y se llevaban a cabo 4 tipos diferentes de experimentos (estándar de A a B, estándar de B a A, albúmina de A a B y homogeneizado de cerebro de B a A) para evaluar el acceso y distribución de fármacos en el cerebro, mediante: a) la sustitución de la monocapa celular por una más compleja (hCMEC/D3) y b) la sustitución del homogeneizado cerebral por una nueva formulación “ libre de animales ”. Ambas estrategias demostraron ser capaces de predecir los siguientes parámetros: el coeficiente de reparto plasma-cerebro libre (Kpuu,brain), la fracción libre de fármaco en plasma (fu, plasma), la fracción libre de fármaco en cerebro (fu,brain) y el volumen aparente de distribución en cerebro (Vu,brain) y constituir herramientas de cribado de alto rendimiento que contribuyen a la reducción, el refinamiento y el remplazo de animales en la investigación.

A continuación, los datos in vitro obtenidos con la metodología mencionada anteriormente se combinaron con información in silico e in vivo para obtener un nuevo modelo semifisiológico que, mediante el uso de ecuaciones diferenciales y varias relaciones cuantitativas estructura-propiedad (QSPRs) fue capaz de predecir los perfiles cerebrales completos de varios fármacos en ratas.

Finalmente, se elaboraron dos nanopartículas diferentes, nanopartículas de sílice mesoporosa (MSN) y nanopartículas magnéticas de sílice mesoporosa (M-MSN), cargadas con ponatinib, un inhibidor de la tirosina quinasa indicado para el tratamiento del glioblastoma. Ambos tipos de partículas se caracterizaron y testaron in vitro e in vivo, demostrando que no son tóxicas para las células BHE y que pueden incrementar la cantidad de fármaco que llega al cerebro cuando se administran por vía intranasal en comparación con los resultados obtenidos para el fármaco libre.

The access and distribution of drugs in the central nervous system (CNS) is one of the limiting steps when treating pathologies that affect both the brain and/or the spinal cord due to the presence of the blood-brain barrier (BBB). In addition, the prevalence of these pathologies increases worldwide year after year and most of the clinical trials carried out with new molecules to treat them fail after huge amounts of money have been invested.

So, in this thesis, (1) the in vitro methodology for determining the permeability of the BBB has been optimized, (2) several in vitro/in vivo correlations (IVIVCs) have been obtained which can relate the results obtained using the in vitro methodology with in vivo data coming from rats, (3) a new mathematical model which is able to predict the distribution of drugs in the brain has been developed and (4) a couple of new nanostructures which increase the access of ponatinib to the CNS have been succeed.

First, a previously proposed BBB model, in which two different monolayers (MDCK and MDCK-MDR1) were used to simulate the BBB and 4 different types of experiments (Standard A to B, standard B to A, albumin A to B and brain homogenate B to A) were carried out to evaluate the access and distribution of drugs in the brain, was optimized by means of: a) substituting the cell monolayer by a more complex one (hCMEC/D3) and b) substituting the brain homogenate by a new “animal-free” formulation. Both approaches proved to be able to predict the following parameters: the unbound plasma–brain partition coefficient (Kpuu,brain), the unbound fraction of drug in plasma (fu,plasma), the unbound fraction of drug in brain (fu,brain) and the apparent volume of distribution in brain (Vu,brain) and constitute high-throughput screening tools which contribute to the reduction, refinement and replacement of animals in research.

Then, the in vitro data obtained with the methodology mentioned above were combined with in silico and in vivo information to obtain a new semi-physiological model which, by means of using differential equations and several Quantitative Structure–Property Relationships (QSPRs) was able to predict the complete brain profiles of several drugs in rats.

Finally, two different nanoparticles, mesoporous silica nanoparticles (MSNs) and magnetic mesoporous silica nanoparticles (M-MSNs), loaded with ponatinib, a tyrosine kinase inhibitor indicated for the treatment of glioblastoma, were prepared. Both types of particles were characterized and tested in vitro an in vivo, proving that they are not toxic for BBB cells and that they can increase the amount of drug that reaches the brain when they are administered intranasally in comparison with the results obtained by the free drug.