Combinación de una terapia enzimática con nanotecnología para el tratamiento del cáncer

Abstract

La terapia enzimática suicida consiste en dirigir una enzima hacia el tumor y, a continuación, administrar de forma sistémica un profármaco inocuo que debe ser sustrato de la enzima y que, al ser procesado por ella, se convertirá en un fármaco anticancerígeno activo. En este trabajo se ha evaluado la eficacia del tratamiento con la enzima Daminoácido oxidasa (DAO) de Rhodotorula gracilis junto con D-alanina frente a líneas celulares de carcinoma de páncreas, carcinoma colorrectal y glioblastoma. La DAO cataliza la oxidación de D-aminoácidos, convirtiéndolos en alfa-cetoácidos y amonio y generando H2O2, que induce estrés oxidativo. Concretamente, se ha utilizado una quimera que presenta la DAO unida al domino de unión a colina de la amidasa N-acetilmuramoil-Lalanina (CLytA) de Streptococcus pneumoniae, permitiendo la inmovilización de la enzima en soportes que presenten colina o derivados, como el dietilaminoetanol (DEAE). Los resultados de este estudio demuestran que CLytA-DAO induce un efecto antiproliferativo en la mayoría de las líneas celulares de carcinoma de páncreas, carcinoma colorrectal y glioblastoma utilizadas. Esta disminución de la proliferación celular se debe a un efecto citotóxico causado por el aumento de especies reactivas de oxígeno en el interior celular, que induce daños en el ADN y en la membrana plasmática, así como la disminución del potencial de membrana mitocondrial. Al analizar el efecto de la enzima en células no tumorales, se observó que no se producía muerte celular o bien ésta era significativamente inferior a la observada en las líneas tumorales. La utilización de la DAO quimérica permitió además su inmovilización en nanopartículas magnéticas funcionalizadas con DEAE, lo que aumentó el efecto del tratamiento al mejorar la estabilidad de la enzima a 37°C. Se estudió también la inmovilización en nanopartículas de oro y cápsulas de alginato, aunque el efecto citotóxico disminuyó considerablemente con respecto al observado con la enzima libre. Al analizar el mecanismo de muerte celular, se observó que el tratamiento con CLytA-DAO y D-Ala es capaz de activar diferentes tipos de muerte celular, de modo que en las líneas celulares de carcinoma de páncreas y colon se produce una necrosis regulada mientras que en las de glioblastoma se activa la vía intrínseca de la apoptosis. Entre las diferentes líneas celulares estudiadas hubo dos resistentes al efecto citotóxico inducido por CLytA-DAO, Hs766T de carcinoma de páncreas y HT-29 de carcinoma colorrectal. Al profundizar en el mecanismo de resistencia de ambas líneas celulares, se observó que está relacionado con la sobreexpresión de genes involucrados en mecanismos de detoxificación, en la respuesta frente al estrés oxidativo y en la supervivencia celular. La expresión de estos genes fue estudiada también en biopsias de pacientes de los tres tipos de tumores y, los resultados sugieren que el tratamiento con CLytA-DAO y D-Ala podría ser eficaz en un alto porcentaje de pacientes. Se demostró que la enzima CLytA-DAO también podría ser utilizada en combinación con radioterapia, quimioterapia, o con tratamientos epigenéticos o basados en reducir la reparación del ADN para potenciar el efecto sobre los pacientes. En conclusión, los resultados de este trabajo indican que el tratamiento con CLytA-DAO y D-Ala muestra un gran potencial como estrategia terapéutica anticancerígena, tanto por sí misma como en combinación con otros tratamientos, en pacientes con cáncer de páncreas, colorrectal y glioblastoma.

Suicide enzyme therapy consists of targeting an enzyme to the tumor and then, to administer systemically a harmless prodrug that must be a substrate for the enzyme and that it will become an active anticancer drug after reacting with it. In this work, treatment efficacy with the enzyme D-amino acid oxidase (DAAO) from Rhodotorula gracilis together with D-alanine against pancreatic carcinoma, colorectal carcinoma and glioblastoma cell lines has been evaluated. DAAO catalyzes D-amino acids’ oxidation, converting them into alpha-ketoacids and ammonia and generating H2O2, which induces oxidative stress. Specifically, a chimera has been used, which presents DAAO bound to the choline-binding domain of the N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase (CLytA) from Streptococcus pneumoniae, allowing the enzyme immobilization on supports containing choline or derivatives, such as diethylaminoethanol (DEAE). The results of this study demonstrate that CLytA-DAAO induces an antiproliferative effect in most of the pancreatic carcinoma, colorectal carcinoma and glioblastoma cell lines used. This decrease in cell proliferation is due to a cytotoxic effect caused by the increase in reactive oxygen species inside the cell, which induces damage to DNA and plasma membrane as well as a decrease in the mitochondrial membrane potential. By analyzing the enzyme effect in non-tumor cells, absence or significantly lower levels of cell death were observed in comparison to tumor cell lines. In addition, the use of a chimeric DAAO allowed its immobilization on DEAE-functionalized magnetic nanoparticles, increasing the effect of the treatment by improving the enzyme stability at 37°C. Immobilization in gold nanoparticles and alginate capsules was also studied, although the cytotoxic effect decreased considerably compared to that observed with the free enzyme. Analysis of the cell death mechanisms showed that treatment with CLytA-DAAO and D-Ala triggers different types of cell death. In pancreatic and colorectal carcinoma cell lines a regulated necrosis occurs while in glioblastoma cell lines the intrinsic pathway of apoptosis is activated. Among the different cell lines studied, two of them were resistant to the cytotoxic effect induced by CLytA-DAAO, Hs766T from pancreatic carcinoma and HT-29 from colorectal carcinoma. By deepening in the mechanism of resistance in both cell lines, it was observed that it is related to the overexpression of genes involved in detoxification mechanisms, response to oxidative stress and cell survival. The expression of these genes was also studied in biopsies from patients with each of the three types of tumors, and the results suggest that treatment with CLytA-DAAO and D-Ala could be effective in a high percentage of these patients. In addition, it was shown that the CLytADAAO enzyme could also be used in combination with either radiotherapy, chemotherapy, epigenetic therapy, or therapy based on reducing DNA repair, in order to enhance the effect on patients. In conclusion, the results of this work indicate that treatment with CLytA-DAAO and D-Ala shows a high potential as an anticancer therapeutic strategy, both by itself and in combination with other treatments, in patients with pancreatic and colorectal carcinoma and glioblastoma.