Identification and characterisation of Whirlin as a novel modulator of TRPV1

Abstract

TRPV1 receptor is a molecular transducer for both chemical and physical stimuli in high-threshold afferent neurons (or nociceptors), where it is abundantly expressed and plays an essential role in pain physiopathology. TRPV1 is known to interact with different proteins which modulate receptor activity and/or trafficking to the membrane. The formation of these multiproteic complexes, called signalplexes or transducisomes, can alter the activity and/or activation thresholds of TRPV1 receptor and it is crucial for the regulation of channel function. For this reason, the identification of new components of these signalling complexes would allow a more complete understanding of TRPV1 physiopathology, knowledge essential for the development of new pharmacological treatments. In this context, the present study describes the interaction between TRPV1 and Whirlin, a cytosolic protein with PDZ domains previously identified through a yeast two hybrid assay by using the N-terminus of TRPV1 as bait. Specifically, the heterologous expression of Whirlin increases TRPV1 protein levels and promotes the clustering of the receptor to the plasma membrane. Whirlin downregulation through specific silencing RNA results in the concomitant degradation of TRPV1 receptor, which can be prevented by proteasome inhibition. Furthermore, the degradation kinetics of TRPV1 upon arresting protein translation mirrored that of Whirlin in cells co-expressing both proteins, suggesting a parallel degradation mechanism. Finally, Whirlin coexpression attenuated TRPV1 internalisation upon prolonged exposure to the agonist capsaicin. Together, these findings indicate that the assembly of both proteins in a same complex stabilises TRPV1 expression and localisation in the plasma membrane, suggesting that the pharmacological perturbation of this macromolecular complex may represent a novel therapeutic strategy for pain management.

El receptor TRPV1 es un transductor de estímulos químicos y físicos en las neuronas aferentes de alto umbral o nociceptores donde se expresa de forma abundante, y juega un papel esencial en la fisiopatología del dolor. Numerosas evidencias demuestran que el receptor TRPV1 interacciona activamente con diversas proteínas celulares que modulan su actividad y/o su tráfico hacia la membrana plasmática. La formación de estos complejos multiproteicos, llamados también signalosomas o transducisomas, puede alterar la actividad del receptor TRPV1 y/o su umbral de activación y juega por lo tanto un papel crucial en la regulación de su función. Por esta razón la identificación de nuevos componentes de estos complejos de señalización nos permitiría alcanzar un mejor conocimiento de la fisiopatología del receptor TRPV1, que se podría trasladar al desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos. A este propósito, el presente trabajo describe la interacción del receptor TRPV1 con una proteína citosólica con dominios PDZ, conocida como Whirlin, inicialmente identificada mediante la técnica de doble híbrido en levaduras utilizando como cebo el dominio citosólico N- terminal de TRPV1. La coexpresión heterologa de Whirlin resulta en un aumento de la expresión del receptor TRPV1 y promueve la agrupación de receptores en la membrana plasmática. Por otro lado, el silenciamiento genético de Whirlin mediante ARN de interferencia resulta en la concomitante degradación del receptor TRPV1, que puede ser bloqueada por el tratamiento con un inhibidor del proteasoma. La degradación del receptor TRPV1, tras la inhibición de la síntesis proteica, sigue la misma cinética de degradación que Whirlin. Finalmente, la coexpresión de Whirlin reduce la internalización de TRPV1 inducida por la exposición prolongada al agonista del receptor, la capsaicina. En conjunto, estos resultados indican que el ensamblaje de ambas proteínas en un mismo complejo proteico estabiliza la expresión del receptor TRPV1 y su localización en la membrana plasmática, lo que conlleva a pensar que la perturbación farmacológica de dicho complejo macromolecular podría representar una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento del dolor.