Estudio estructural y aplicaciones biomédicas de los módulos de unión a colina: Antimicrobianos frente a Streptococcus pneumoniae

Abstract

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una de las bacterias mundialmente más relevantes causante de varias enfermedades como neumonías, meningitis y otitis media. La vacunación contra neumococo y el tratamiento con antibióticos constituyen dos estrategias de lucha contra este patógeno que resultan incompletas debido a la enorme variedad serotípica de este microorganismo y a los crecientes niveles de resistencia a los antibióticos. Estos problemas inducen a la búsqueda de dianas terapéuticas alternativas frente a las que se desarrollen nuevos antimicrobianos que soslayen las complicaciones derivadas de la resistencia a antimicrobianos. Las proteínas de unión a colina (CBPs) de S. pneumoniae comprenden una familia de polipéptidos modulares involucrados en eventos esenciales para la viabilidad y virulencia de este patógeno. Las CBPs reconocen los residuos de colina presentes en los ácidos teicoicos utilizando los llamados módulos de unión a colina (CBMs), constituidos por motivos repetidos de unos 20 residuos (CBRs, repeticiones de unión a colina). El propósito principal de esta Tesis Doctoral es el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos frente a S. pneumoniae, focalizando la investigación en la familia de las CBPs. En concreto la Tesis se puede dividir en tres líneas en base a cada uno de los compuestos estudiados: Ésteres de aminas bicíclicas (EBAs) Los EBAs son análogos de colina que se diseñaron inicialmente como inhibidores de las CBPs, sin embargo, estudios anteriores demostraron actuar como inhibidores del crecimiento de S. pneumoniae presentando una actividad lítica inesperada. En este trabajo se demuestra que los EBAs actúan como desestabilizadores de la membrana celular. Se ha analizado la actividad inhibidora y desintegradora de los EBAs en biopelículas neumocócicas, el compuesto EBA 31 produjo el mayor efecto sobre las biopelículas de S. pneumoniae, así como en biopelículas mixtas de S. pneumoniae y Haemophilus influenzae no tipificable. Además, los EBAs resultaron ser efectivos frente a la proliferación de promastigotes de Leishmania donovani. Estos resultados respaldan el papel de los EBAs como una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos de amplio espectro, debido posiblemente a su capacidad desestabilizadora de la membrana celular, siendo efectivos frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como frente a patógenos eucariotas. Módulos de unión a colina (CBMs) Se ha estudiado la capacidad de tres CBMs naturales (C-ClytA, C-Cpl1, C-CbpD) y un derivado (LZ-C-LytA) para competir con los CBPs del huésped por el acceso a la colina en la superficie bacteriana, con el objetivo de interferir con la actividad de este último. La interacción de los CBMs con colina libre y mímicos sintéticos de la pared celular se evaluó mediante espectroscopía de fluorescencia y dicroísmo circular, así como resonancia de plasmón superficial. Por otro lado, la adición exógena de CBM a cultivos planctónicos neumocócicos causó el encadenamiento celular, la agregación y la sedimentación bacteriana. Este resultado nos llevó a evaluar la capacidad de los CBMs para promover la fagocitosis bacteriana por los macrófagos peritoneales, lo que sugiere que estos polipéptidos podrían constituir la base para candidatos antimicrobianos prometedores basados en la inducción natural del sistema de defensa del huésped. Péptidos derivados de la autolisina de LytA Estudios previos del laboratorio habían demostrado que la secuencia de un CBR aislado de la autolisina LytA (P4A) dispone de toda la información necesaria para adquirir una estructura similar a la nativa y siendo capaz de reconocer específicamente la colina, aunque con afinidad residual. Con el propósito de encontrar el mínimo requerimiento estructural necesario para obtener un efecto similar al obtenido en las CBMs se llevó a cabo el estudio de versiones simplificadas, del péptido P4A y construcciones derivadas de éste por duplicación y triplicación de la misma secuencia en tándem (P4B y P4C). Se evalúo la interacción de los péptidos por colina libre, así como se estudió el cambio conformacional de horquilla β a hélice α inducido por micelas de detergente. Se comprobó que los péptidos P4B y P4C ejercen un efecto bactericida sobre cultivos in vitro de neumococo debido a la salida prematura de la amidasa LytA causada por la perturbación de la membrana celular. Con el propósito de incrementar su eficacia por efectos de multivalencia se procedió al diseño de dendrímeros conteniendo varias copias del péptido P4A (g2-P4A y g3-P4A). Los compuestos g2-P4A y g3-P4A provocaron la destrucción bacteriana a bajas concentraciones (orden nanomolar) mediante un mecanismo independiente de las enzimas líticas del patógeno y de la presencia de colina en la superficie. Finalmente se evalúo la eficacia del dendrímero g3-P4A en modelos animales de pez cebra demostrando ejerce un efecto protector frente a enfermedad neumocócica.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a Gram-positive bacterium responsible for infections with high impact such as pneumonia, meningitis and otitis media. Pneumococcal vaccination and antibiotic treatment are two strategies to combat this pathogen, but they are incomplete due to the wide serotype variety of S. pneumoniae and the increasing levels of resistance to traditional antibiotics. These problems foster the search for alternative therapeutic targets for the development of new antimicrobials that avoid complications arising from antimicrobial resistance. Choline binding proteins (CBPs) of S. pneumoniae are a family of modular polypeptides that play essential roles for this pathogen. CBPs recognize choline residues present in teichoic acids using the so-called choline binding modules (CBMs), which in turn contain repeated motifs of around 20 residues (CBRs, choline binding repeats). The main purpose of this Doctoral Thesis is the development of new antimicrobial agents against S. pneumoniae, with a focus on the CBP family. This Thesis has been structured in three sections according to the studied compounds: Esters of bicyclic amines (EBAs) EBAs are choline analogs that were initially designed as inhibitors of CBPs. However, previous studies had shown to act as growth inhibitors of S. pneumoniae, displaying an unexpected lytic activity. In this work, we demonstrate that EBAs are destabilizers of the membrane cell. The inhibitory and disintegrating activity of EBAs in pneumococcal biofilms was tested. The EBA 31 compound produced the highest effect in the biofilms of S. pneumoniae, as well as in mixed biofilms formed by S. pneumoniae plus non-typeable Haemophilus influenzae. In addition, EBAs proved to be effective against the proliferation of promishigotes from Leishmania donovani. These results support the role of EBAs as a promising alternative for the development of new broad-spectrum antimicrobial drugs, being effective against Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as against to eukaryotic pathogens.Choline binding modules (CBMs) We have tested the ability of three natural CBMs (C-LytA, C-CbpD, C-Cpl1) and one engineered derivative (LZ-C-LytA) to compete with host CBPs for the access to choline on the bacterial surface, with the aim of interfering with CBPs activity. The interaction of the CBMs with free choline and synthetic cell-wall mimics was evaluated by fluorescence and circular dichroism spectroscopies, as well as surface plasmon resonance. On the other hand, exogenous addition of CBMs to pneumococcal planktonic cultures caused cell-chaining, bacterial aggregation and sedimentation. This result prompted us to assess the capacity of CBMs to promote bacterial phagocytosis by peritoneal macrophages, suggesting that these polypeptides might constitute a promising basis for antimicrobial candidates based on the natural induction of the host defense system. Peptides derived from LytA autolysin Previous laboratory studies had shown that an isolated CBR from the pneumoccocal LytA autolysin (P4A) has sufficient information to acquire a native-like structure, being able to recognize choline, although with residual affinity. In order to find the minimum number of repeats necessary to obtain a similar effect than natural CBMs, the analysis of simple constructions resulted from duplication and triplication of the P4A sequence (P4B and P4C peptides) was carried out. Next, we evaluated the interaction of the peptides with free choline, as well as the conformational change from β-hairpin to α-helix as induced by detergent micelles. Moreover, P4B and P4C peptides showed bactericidal activity in pneumococcal cultures due to the premature release of LytA amidase caused by cell membrane alteration. In order to increase its effectiveness through multivalence effects, dendrimers with several copies of P4A peptide (g2-P4A and g3-P4A) were synthetized and assayed. Here we demonstrate that g2-P4A and g3-P4A compounds are potent antimicrobials at very low concentrations (nanomolar order) by a mechanism independent of host lytic enzymes or the presence choline on the surface. Finally, assays on zebrafish infection models showed that g3-P4A exerts a protective effect against pneumococcal disease in vivo.