Caracterización genética y molecular de los genes RE e ICU2 de Arabidopsis thaliana

Abstract

Con el objetivo de contribuir a la disección genética de la ontogenia foliar, hemos obtenido y estudiado varias estirpes mutantes de Arabidopsis thaliana que presentan alteraciones en la morfología de sus hojas vegetativas, a las que hemos denominado venosa (ven) e incurvata2 (icu2). Las razones de nuestro interés inicial por estos mutantes fueron las siguientes: Las hojas vegetativas de los mutantes ven presentan una red vascular intensamente verde, que destaca sobre un limbo pálido, lo que sugiere que sufren alteraciones en la biogénesis de los cloroplastos, la diferenciación del mesófilo, o ambas; El margen de las hojas vegetativas del mutante icu2-1 está ligeramente recurvado hacia el haz y en su epidermis se observan grupos de células de tamaño reducido, lo que podría deberse a perturbaciones en la especificación de la dorsoventralidad o en los mecanismos de coordinación del crecimiento de los tejidos dorsales y ventrales de este órgano. En esta Tesis Doctoral hemos caracterizado seis alelos recesivos del gen RETICULATA (RE; VEN2) y demostrado que su fenotipo foliar reticulado se debe a una gran reducción en la densidad de las células del mesófilo intervenal. Las hojas de las plantas re/re presentan una ligera disminución en tamaño y una forma casi normal, a pesar de que les faltan numerosas células del mesófilo, que son sustituidas por espacios aéreos intercelulares, lo que sugiere que el correcto desarrollo de los tejidos internos incide poco en la forma final del órgano, que parece depender en mayor medida de la epidermis. También apoya esta hipótesis la observación de que las células de la epidermis foliar de los mutantes re son aparentemente normales en tamaño y morfología. Hemos clonado posicionalmente el gen RE y caracterizado molecularmente sus alelos, varios de los cuales parecen nulos. RE es LCD1, que había sido identificado por otros autores en base a la sensibilidad al ozono y a Pseudomonas syringae causada por lcd1-1, su único alelo conocido previamente (Barth y Conklin, 2003), y codifica una proteína de función desconocida y expresión ubicua. Nuestros resultados indican que los alelos re hipomorfos o nulos perturban específicamente la división de las células del mesófilo en estadios tempranos de la organogénesis foliar. Hemos demostrado además que la reticulación foliar es un rasgo externo útil como criterio selectivo para el aislamiento de mutantes con anomalías en la arquitectura interna de la hoja. Hemos estudiado las interacciones genéticas entre RE y su parálogo más cercano, al que hemos denominado RE2, cuyo alelo nulo re2-1 no tiene manifestación fenotípica. El análisis de la progenie de varios cruzamientos re/re  re2-1/re2-1 indica que los genotipos re/re;re2-1/re2-1 y RE/re;re2-1/re2-1 son letales, mientras que re/re;RE2/re2-1 causa sinergia fenotípica, lo que sugiere que RE y RE2 son redundantes y necesarios no sólo para la organogénesis foliar sino también para el desarrollo reproductivo y embrionario. La obtención del doble mutante cue1-5/cue1-5;re-3/re-3 nos ha permitido establecer que cue1-5 es epistático sobre re-3, lo que indica que RE participa en la ruta del shikimato. Hemos clonado posicionalmente otros dos genes cuya insuficiencia de función provoca un fenotipo reticulado, comprobando que VEN4 codifica una fosfohidrolasa y VEN5, otro parálogo de RE, una proteína de la envuelta del cloroplasto, ambas de función desconocida. Estamos intentando determinar la naturaleza molecular de otros tres genes VEN (VEN1, VEN3 y VEN6) mediante un abordaje posicional similar al que nos ha permitido identificar RE, VEN4 y VEN5. Además de su fenotipo foliar, el mutante icu2-1 muestra floración temprana y transformaciones homeóticas parciales entre órganos florales, similares a las causadas por la insuficiencia de función del gen de identidad de órgano floral AP2, que a su vez causa la desrepresión ectópica de AG. Hemos comprobado mediante RT-PCR cuantitativa que en las hojas del mutante icu2-1 se expresan ectópicamente, entre otros, los genes AG, AP1, AP3, PI, SEP3, CAL, FUL y FT, todos los cuales codifican factores de transcripción. La desrepresión de AG causa el fenotipo foliar del mutante icu2-1, y la de FT su floración temprana, ya que las mutaciones de insuficiencia de función ag-1 y ft-1, respectivamente, suprimen dichos rasgos. Hemos clonado posicionalmente el gen ICU2, que codifica la subunidad catalítica de la ADN polimerasa . El alelo icu2-1 es hipomorfo y probablemente modifica la estructura tridimensional de la proteína ICU2, pero no parece reducir su actividad polimerasa. Los alelos insercionales y aparentemente nulos icu2-2 e icu2-3 causan letalidad gamética y embrionaria, tal como cabe esperar del papel esencial de la ADN polimerasa  en la replicación. La obtención de dobles mutantes nos ha permitido establecer que las mutaciones clf, tfl2 y emf2 interaccionan sinérgicamente con icu2-1. Este análisis de interacciones sugiere la existencia en Arabidopsis thaliana de un mecanismo de silenciamiento génico mediado por la cromatina similar al que se ha descrito para algunas levaduras y animales, en el que las marcas epigenéticas y el ADN se replican simultáneamente. Proponemos que la polimerasa ICU2 participa en la unión de TFL2 a las histonas, contribuyendo así al marcaje epigenético de la cromatina de manera casi simultánea a la replicación.