Caracterización biofísica de las regiones membrano-activas de proteínas estructurales y no estructurales del virus del Dengue

Abstract

El virus del Dengue perteneciente a la familia Flaviviridae, es el arbovírus (transmitido por un artrópodo, en este caso mosquitos del género Aedes) causante de las mayores tasas de mortalidad y morbilidad en todo el Mundo, con aproximadamente 400 millones de infecciones estimadas anualmente en los trópicos y sub-trópicos [109]. La infección por este virus se caracteriza por cuatro cuadros clínicos distintos, con creciente grado de severidad: infección sin síntomas, fiebre del Dengue (DF en inglés), fiebre hemorrágica del Dengue (DHF en inglés) y sindroma de choque del Dengue (DSS en inglés). A pesar de su alta prevalencia, en la actualidad no existen ni vacunas ni fármacos antivirales para contrarrestar esta enfermedad, siendo el control de las poblaciones de vectores la única medida utilizada a gran escala [55, 107, 117]. Este virus se clasifica en cuatro serotipos distintos que comparten un 69-78% de identidad a nivel de secuencia primaria [356] y se compone de una nucleocapsida, formada por múltiples copias de la proteína C asociada al genoma vírico, envuelta por una capa lipídica derivada del huésped donde se encuentran 180 copias de las proteínas M y E asociadas en heterodimeros. El genoma vírico es una molécula de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva y tiene aproximadamente 11 kb con un único marco abierto de lectura (ORF en inglés) que codifica una única poli proteína que, tras su procesamiento por proteasas virales y del huésped, da lugar a tres proteínas estructurales C, prM y E y siete proteínas no-estructurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 [79, 119]. Este virus entra en las células por endocitosis mediada por receptores y el pH ácido en el interior del endosoma induce un cambio conformacional que hace que el péptido de fusión, localizado en la proteína E (una proteína de fusión de clase II) se acerque a la membrana del endosoma y se dé el proceso de fusión con consecuente liberación de la nucleocapsida en el citoplasma [365]. Los procesos de replicación del genoma vírico y ensamblaje de las partículas virales ocurren en membranas derivadas del retículo endoplásmico, criadas y reorganizadas por proteínas del virus. Tras su ensamblaje, las partículas víricas inmaduras inician su tránsito por el complejo trans- Golgi donde una disminución del pH intravesicular promueve la acción de la enzima furina que rompe el enlace peptídico entre el péptido pr (cubre el péptido de fusión y previene una fusión prematura antes de la salida del virus) y la proteína M en la proteína prM. Tras exocitosis, la liberación del péptido pr representa el paso final de maduración. Tanto en procesos de entrada y salida del virus como en los pasos de replicación y ensamblaje, todas las proteínas del virus necesitan y utilizan membranas lipídicas para ejecutar sus funciones, ya que inducen cambios estructurales en aquellas para formar sus complejos de replicación, para llevar a cabo el proceso de fusión y asegurar ensamblaje viral. Los efectos de las proteínas estructurales y no estructurales del virus del Dengue en membranas son conocidos, pero los mecanismos por los cuales estas alteraciones se producen no están definidos, aún menos las proteínas implicadas y las regiones membrano-activas de estas proteínas son casi desconocidas. Como tal, nos propusimos definir las regiones membrano-activas de las proteínas de este virus, tanto las estructurales (C, prM y E) como las no-estructurales de cuyas funciones se sabe muy poco. La proteína C forma dímeros formados mayoritariamente por hélices 􀁄, en los cuales se encuentran dos regiones con características interesantes a nivel de interacciones moleculares, una región altamente hidrofóbica que sugiere una interacción con membranas [215] y otra región con una gran concentración de carga positiva que podría interaccionar con el genoma vírico [219]. Se sabe que esta proteína es responsable de la encapsidación especifica del genoma [79, 219] y que se acumula en vesículas lipídicas derivadas del retículo endoplásmico [218]. En esta proteína hemos identificado dos regiones membrano-activas correspondientes a la región altamente hidrofóbica de los residuos 39 al 56 y a la secuencia señal en la región C-terminal. La proteína E es una proteína de fusión de clase II, cuya región N-terminal (residuos 1 al 395) se divide en tres dominios formados por estructuras beta [54, 119], dominio I N-terminal, flanqueado en un lado por el dominio II que contiene el péptido de fusión (residuos 98 a 112) y por otro el dominio III que es la región de anclaje a membrana y donde se encuentran los sitios de unión a receptores. La región C-terminal de esta proteína estaría formada por una región tallo y dos dominios transmembrana con estructura helicoidal. Estas regiones contribuyen en los cambios conformacionales necesarios en el proceso de fusión y las regiones transmembrana estarían involucradas en interacciones proteínaproteína o lípido-proteína [75, 164, 285, 360]. Encontramos cinco regiones membranoactivas en esta proteína que coinciden con el péptido de fusión (residuos 88 a 122), una región rica en prolina, de interacción con proteínas (residuos 198 a 221), otra región 243 coincidente con una zona hidrofóbica previamente descrita (residuos 270 a 309), una región correspondiente una parte de la zona tallo (residuos 406 a 422) y finalmente una región de los residuos 428-479 que contiene parte de la región tallo y uno de los dos dominios transmembrana descritos. Estos resultados definen las regiones de esta proteína que interaccionan con membranas y demuestran la importancia de las mismas en las interacciones en las cuales la proteína nativa tiene un papel activo. Un péptido procedente de la proteína C de los residuos 39 al 56, DENV2C6, localizado en una región altamente hidrofóbica del dímero de aquella proteína, el cual es necesario en los procesos de maduración vírica, unión a vesículas lipídicas y ensamblaje viral [215, 218] induce efectos significativos en membranas modelo. Se une con alta afinidad a variadas membranas modelo, sin una distinción clara entre membranas de diferente composición lipídica e induce una rotura casi completa de membranas lipídicas de variada composición. También es capaz de modificar el comportamiento termo trópico de variadas biomembranas, induciendo la formación de fases con diferente distribución peptídica y afectando la anisotropía de fluorescencia de una sonda localizada en el interior de la bicapa lipídica. Este péptido afecta extensivamente a membranas con BMP, un lípido encontrado principalmente en endosomas [161], lo que indicaría una posible función en la fusión del virus con membranas durante la infección. Además, como se puede observar en los experimentos de espectroscopia infrarroja (Figura 5, P2), la estructura secundaria de este péptido sufre cambios en presencia de membranas, especialmente en membranas de DMPC, donde su estructura cambia significativamente en comparación con el péptido en disolución. Las proteínas NS4A y NS4B son proteínas altamente hidrofóbicas involucradas en diversas funciones en el ciclo viral. Se sabe que la proteína NS4A modula la ATPasa de NS3 [265], se localiza en el complejo de replicación con otras proteínas estructurales y que se encuentra en membranas del retículo endoplásmico pudiendo modular la curvatura de membranas [264, 267]. Además, esta proteína parece ser importante en la inhibición de la respuesta por interferón [263], aparte de contribuir para reducir la apoptosis celular a través de la activación de autofagia, alargando la vida celular [271]. Un modelo topológico recientemente descrito define dos segmentos transmembrana separados por un segmento que estaría en contacto con la membrana y un fragmento 2k en su región C-terminal, fundamental para la translocación de la proteína NS4B hacia el lumen del retículo endoplásmico [264]. Pudimos definir dos regiones capaces de 244 afectar a la estructura e integridad de membranas lipídicas de los residuos 52 al 90 y de los residuos 90 al 125, coincidente con los segmentos transmembrana definidos en el modelo topológico referido arriba. El segmento 2k en la zona C-terminal de esta proteína parece no afectar a la integridad de membranas derivadas del retículo endoplásmico lo que sugiere un posible cambio conformacional dependiente de la composición lipídica, un fenómeno muy común en procesos de modulación de membranas de muchos ciclos virales. En cuanto a la proteína NS4B, esta parece ser la proteína de mayor importancia en la inhibición de la respuesta por interferón de las células infectadas, inhibiendo la fosforilación de STAT1 [273]. Su co-localización con ARN de cadena doble y las proteínas NS3 y NS5 sugiere que podrá participar en la replicación viral [275]. Además, esta proteína forma dímeros a través de una región denominada bucle citosólico. Esto demuestra su papel doble en interacciones proteínalípido y lípido-lípido [276]. En su modelo topológico más reciente, esta proteína se compone de al menos tres regiones transmembrana precedidas por dos dominios que podrían interaccionar con membranas [272]. Definimos cuatro segmentos membranoactivos en esta proteína, de los residuos 50 al 80, 94 al 127, 163 al 190 y 210 al 240 y al menos uno de posible interacción con membranas coincidente con la región de dimerización. De estos resultados se puede concluir que esta proteína participa activamente en la modulación y reorganización de membranas así como en la interacción con otras proteínas. La proteína prM se compone de dos regiones distintas, el péptido pr de los residuos 1 al 91 y la proteína M de los residuos 91 al 166, formada a su vez por una región tallo de los residuos 112 al 132, seguida de dos regiones transmembrana [125, 208, 209, 223]. A parte su función de prevención de una fusión prematura, protegiendo al péptido de fusión, esta proteína parece jugar un papel en el transporte intracelular y en la regulación de apoptosis [224-228]. Se descubrió recientemente que esta proteína forma oligomeros en membranas derivadas del retículo endoplásmico al mismo tiempo que reorganiza estas membranas [102]. Aplicando la metodología supra citada pudimos definir al menos una región de interacción con proteínas en la región del péptido pr, que sería la región de contacto con la proteína E, y una región no-transmembrana de interacción con membranas. En la proteína M se detectaron las regiones transmembrana de esta proteína y la región tallo que parece modular el comportamiento termo trópico 245 de las membranas estudiadas. Estos resultados parecen confirmar la interacción de esta proteína con membranas y definen las regiones involucradas en esa función. La proteína NS2A es la proteína menos estudiada y caracterizada de todas las proteínas de este virus pero los estudios realizados hasta el momento parecen indicar un papel muy importante de esta proteína en todo el ciclo. Se integra en el complejo de replicación [261], es necesaria para el ensamblaje viral, ya que mutaciones en esta reducen significativamente la carga viral [260], es necesaria para el procesamiento de la proteína NS1 [260] y, en concierto con las proteínas NS4A y NS4B, inhibe la respuesta por interferón [263]. Es una proteína altamente hidrofóbica y está formada por al menos cinco regiones transmembrana y dos regiones de interacción con membranas [260]. Su localización en membranas y fuerte carácter hidrofóbico sugieren que esta proteína es capaz de reorganizar membranas lipídicas y con eso contribuir a la formación de los complejos de replicación viral. Definimos dos regiones de interacción con membranas en esta proteína de sus residuos 25 al 41 y de los residuos 103 al 183. La primera región coincide con una de las regiones de interacción con membranas sugerida en el modelo topológico y su efecto parece depender de la composición lipídica. Esta región fue estudiada en mayor detalle y comprobamos que su efecto en membranas es dependiente tanto de la composición lipídica como de la fuerza iónica de su entorno. El componente electrostático de esta interacción es predominante y su efecto selectivo nos permite sugerir que esta región podría adoptar diferentes conformaciones en membranas y alternar entre una orientación en contacto directo o no con aquellas y así afectar a la conformación y función de la proteína nativa. Estos resultados motivaron la elaboración de esta tesis doctoral, la publicación de tres artículos científicos, el envío de otros dos para su publicación y variadas comunicaciones a congresos nacionales e internacionales.

Dengue virus, part of the Flaviviridae family is the most prevalent virus in the human population and is responsible for the highest morbidity and mortality rates worldwide, with about 400 million infections estimated yearly in tropics and subtropics [109]. People infected by DENV present symptomatology with varying severity degrees: asymptomatic, Dengue fever (DF), Dengue haemorrhagic fever (DHF) and Dengue Shock syndrome (DSS). Despite its prevalence, there are currently neither effective antivirals nor antiviral drugs against DENV, being the sole eradication strategies based on the control of mosquito populations [55, 107, 117]. This virus is classified into three distinct serotypes with 69-78 % primary sequence identity [356] and it is composed of a nucleocapsid, formed by several molecules of protein C bound to the viral RNA genome, enclosed by a host derived lipid bilayer where 180 copies of proteins M and E are embedded as heterodimers. Its positive single-stranded RNA genome of some 11 kb possesses a single ORF that encodes a single polyprotein of about 3000 amino acids. After appropriate processing by viral and host proteases, this polyprotein gives rise to three structural proteins C, prM and E and seven non-structural proteins NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5 [79, 119]. DENV enters cells by receptor mediated endocytosis and the decrease in pH inside endosomes triggers a conformational change that results in the insertion of the fusion peptide (located in protein E, a class II fusion protein) into the endosomal membrane, resulting in the release of the nucleocapsid into the cytoplasm [365]. Viral replication and assembly processes occur in ER-derived membranes, sequestered and reorganized by the virus. Following its assembly, the immature virions start their transit through the trans-Golgi network, where a decrease in pH triggers the furin cleavage of the peptide bond between the pr peptide and the M protein. When the virion is exocyted, the pr peptide is released and the viral particle is rendered fully mature. Both in entry and exit steps, all viral proteins require and use membranes to exert their functions, e.g. by modulating their structure to form replication complexes, to execute their fusion process or even to carry out viral assembly. The effects DENV proteins have on membranes are known, yet the mechanisms by which those occur are elusive, the proteins involved are even less known and the exact regions in those proteins that interact with membranes are virtually unknown. Therefore, we sought to highlight the membrane-active regions of DENV’s structural proteins and the lesser known and most hydrophobic non-structural proteins. Protein C forms mainly 􀁄-helical dimers in solutions, where two regions possess interesting biophysical characteristics: one is highly hydrophobic, suggesting possible membrane interactions [215] while the other has a high positive charge concentration, what would point to a possible interaction with the negatively charged viral RNA genome [219]. It is known that this protein is responsible for the specific encapsidation of the genome [79, 219] and that it accumulates around ER-derived lipid droplets [218]. We have identified two membrane-active regions in this protein, corresponding to the highly hydrophobic region from residues 39 to 56 and its C-terminal signal sequence. Protein E is a class II fusión protein with its N-terminal region (residues 1 to 395) divided into three domains formed by beta structures [54, 119], an N-terminal domain I, flanked on one side by domain II (where the fusion peptide is located between residues 98 to 112) and on the other by domain III, the putative location of the receptor binding sites. Its C-terminal region would be composed of a stem region followed by two helical transmembrane domains. These regions contribute to the conformational changes required for membrane fusion and the transmembrane regions would be involved in protein-lipid and lipid-lipid interactions [75, 164, 285, 360]. We have found at least five membrane-active regions in this protein, coincident with the fusion peptide (residues 88 to 122), a proline-rich region involved in protein-protein interaction (residues 198 to 221), another previously described hydrophobic region (residues 270 to 309), a region coincident with the stem region (residues 406 to 422) and finally a region from residues 428 to 479 that contains part of the stem region and one of the previously described transmembrane domains. These results define the membrane interacting regions of these proteins and corroborate the importance of these in the interactions of native proteins. A peptide derived from protein C from residues 39 to 56, DENV2C6, located in a highly hydrophobic region in the C protein dimer, required for appropriate viral maturation, vesicle binding and viral assembly [215, 218] induces significant effects to membrane model systems. It binds with high affinity to several membrane models and ruptures them with no clear distinction between membranes with different composition, It can also modulate the thermotropic behaviour of membranes, inducing the formation of lipid phases with different peptide concentrations and altering the steady-state fluorescence anisotropy of probes inserted into the lipid palisade. This peptide significantly affects BMP (a lipid found predominantly in endosomes [161]) containing membranes, what suggests a possible function in viral fusion during infection. Moreover, FTIR experiments have shown that this peptide has different secondary structure in solution and in DMPC membranes, meaning that it is a two way proteinlipid interaction. Proteins NS4A and NS4B are highly hydrophobic proteins involved in several functions in the viral cycle. It is known that NS4A modulates the ATPase function of NS3 [265], co-localizes with other viral proteins in the replication complex and it can be found in ER membranes, modulating its curvature [264, 267]. Furthermore, this protein seems to play a role in the interferon response [263], inhibition of apoptosis through autophagy induction what increases the cellular lifespan [271]. A recently described topology model suggests two transmembrane segments separated by a membrane interacting domain and its C-terminal region is a 2k fragment, responsible for the translocation of NS4B into the ER lumen [264]. We could delineate two regions that affect the structure and integrity of the lipid membrane from residues 52 to 90 and 90 to 125, matching the transmembrane segments of the topological model. The 2k fragment does not seem to affect ER membranes, what would suggest conformational changes dependent on lipid composition, a fairly common process of membrane modulation in viral cycles. As for protein NS4B, it seems to be the most important protein in interferon response inhibition by inhibiting the STAT1 phosphorylation [273]. Its colocalization with dsRNA and proteins NS3 and NS5 suggests it might play a role in the viral replication [275]. Adding to that, this protein forms dimers through a cytosolic loop. These findings provide a clear indication of its hybrid lipid-lipid and protein-lipid interacting capabilities [276]. In its most recent topology model, this protein is composed of at least three transmembrane domains preceded by two membraneinteracting domains [272]. We highlighted four membrane-active segments in this protein from residues 50 to 80, 94 to 127, 163 to 190 and 210 to 240 and at least one segment coincident with the dimerization region that could interact with membranes. We conclude that this protein actively modulates and reorganizes membranes and also possibly interacts with other proteins.