Efecto antiproliferativo de extractos procedente de invertebrados marinos mediado por estrés en modelos celulares humanos de cáncer de colon

Abstract

Cancer i s o ne o f t he l eading c auses o f d eath w orldwide and requires the attention and e ffort o f t he s cientific c ommunity f or t he d evelopment o f n ew strategies a nd t he d iscovery o f d rugs t hat h elp f ight t he d isease [1]. It is necessary to discover novel effective therapies focused on avoiding cancer cell proliferation and reducing side effects. Marine compounds, produced to survive in response to harsh and competitive environmental conditions, are postulated as a potential anticancer source. In the last decades, marine metabolites have shown novel wide chemical structures, which have been attributed to interesting biological activities and this fact has been registered by the increasing numbers of drugs approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA). In particular, marine invertebrates are considered one of the richest biodiverse groups. To date, a large number of natural products e xtracted o r s ynthesized b ased o n m arine c ompounds f rom invertebrates have been established as antineoplastic drugs. In chapter 1, the current marine natural products (MNPs) that have been established as antineoplastic drugs were reviewed and their putative mechanisms of action in the different hallmarks of cancer described, giving an overview o f t he r ichness o f t he c hemical s tructures t hat t hey o ffer a nd introducing the use of virtual screening for drug discovery. This t hesis, in chapter 2, f ocuses o n t he search o f t he antiproliferative effect of several invertebrate marine extracts in human colon cancer cell models. The first part of the project focuses on the search for marine organisms that have intra and interspecific competence through the production of bioactive compounds. A selection of 20 organisms was made based on bibliographic sources and relayed on observations of competence in experimental aquariums. The next part consisted in to screen the in vitro antiproliferative effect on a panel of colon cancer cell models. Four extracts were selected due to their potential cytotoxic effect: Phyllidia varicosa (NA extract) and Dolabella auricularia (NB extract), obtained from two nudibranchs, Carotalcyon sp (CR extract) obtained from a soft coral and Pseudocolochirus violaceus (PS extract) from a holothurian. The main bioactive compounds (98 compounds) represented in these four extracts were identified using an HPLC-ESI-TOF-MS analysis. Among the most abundant compounds characterized in each extract, terpenes and diterpenes, and steroids (CR); cembranolides (PS); diterpenes, polyketides and indole terpenes (NA); and porphyrin, drimenyl cyclohexanone and polar steroids (NB), were proposed to be the candidates for the observed activity. CR, PS, NA, and NB showed strong antiproliferative ability and a cytostatic effect arresting the cell cycle in the G2/M phase. Likewise, CR, NA and NB extracts induced early apoptosis and PS extract exerted necrotic cell death. The four extracts showed a remarkable effect consisting on a dramatic intracellular reactive oxygen species (ROS) accumulation and mitochondrial depolarization, caspase activation and DNA damage. In Chapter 3 , the e ffect o f m arine natural p roducts a s i nhibitors o f rapamycin t arget ( mTOR) i n m ammals w as s tudied. T his kinase i s a master regulator of cell growth and metabolism and is deregulated in many types of cancer. Our results showed evidence of 11 pure compounds (selected by molecular coupling and calculated ADMET parameters) and two marine extracts to inhibit mTOR with the same effectiveness. Finally, in Chapter 4, we explored in depth the antiproliferative effect of NB extract mediated by an induction of oxidative and endoplasmic reticulum stress i n t he human c olon c ancer c ell m odel H CT-116. First, we found an overexpression o f e ndoplasmic r eticulum ( ER) s tress markers a nd a n overproduction of reactive oxygen species (ROS) basally in the colon cancer cell model compared to the normal colon cells. This difference in the basal stress level made the tumor cells more sensitive to the NB extract. The results suggest that NB extract significantly increases cellular stress by inducing ROS and overexpressing proteins related to ER stress through the response to unfolding proteins. In addition to the antiproliferative capacity, the ability of NB to inhibit one o f t he m ost d angerous c haracteristics o f t umor c ells, t he migration a nd invasion qualities of superinvasive models from HCT-116 was studied. The results were promising in showing that NB significantly reduced the migration and invasion rate of the most superinvasive populations with a smaller effect on the non-tumor line. This thesis, therefore, demonstrates t hat marine c ompounds a re a potential source of anti-cancer drugs due to the chemical diversity and broad biological activity that they offer. This fact is r eflected i n t he i ncrease i n t he number of drugs of marine origin that have been approved to date and the large number of scientific studies related to the field that are underway. In addition, this thesis offers interesting results about potential antitumor activity from marine invertebrate extracts and reveals some strengths of its mechanism of action. Likewise, the present study offers results of how the new strategies of computational screening that allow the search of regulatory compounds of key targets against cancer increase the effectiveness in the search of antitumor compounds.

El c áncer e s u na d e l as principales c ausas d e muerte e n t odo e l m undo y requiere la atención y el esfuerzo de la comunidad científica para el desarrollo de nuevas estrategias en el descubrimiento de fármacos que ayuden a combatir la enfermedad [1]. Es necesario descubrir nuevas terapias efectivas que se centren e n e vitar l a p roliferación de células cancerosas y evitar los efectos secundarios. Los compuestos marinos, producidos como consecuencia de un intento de supervivencia ante condiciones adversas y de competencia, se presentan como una fuente potencial contra el cáncer. En las últimas décadas, los metabolitos marinos han mostrado una oferta de estructuras químicas novedosas a las que se le han atribuido actividades biológicas interesantes. Este hecho q ue q ueda r egistrado p or e l c reciente n úmero d e m edicamentos aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) y l a Agencia E uropea d e M edicamentos ( EMA) d e o rigen marino. E n particular, los invertebrados marinos se proponen como fuente potencial de moléculas bioactivas por representar uno de los grupos más biodiversos. Hasta la fecha, una gran cantidad de productos naturales han sido extraídos o sintetizados en base a compuestos marinos de invertebrados y se han establecido como fármacos antineoplásicos. En e l c apítulo 1 d e e sta t esis, se r evisaron los actuales productos naturales marinos (MNP) que se establecieron como medicamentos antineoplásicos, describiendo sus posibles mecanismos de acción contra dianas moleculares e specíficas c ontra e l c áncer, b rindando u na v isión g eneral d e l a riqueza de las e structuras químicas q ue o frecen e introduciendo el uso d e la detección virtual para el descubrimiento de fármacos. Esta tesis, en el capítulo 2, se incluyen resultados sobre la búsqueda del efecto antiproliferativo de extractos marinos procedentes de invertebrados en modelos de células de cáncer d e c olon h umano. L a p rimera p arte d el p royecto se c entró e n l a búsqueda d e o rganismos m arinos q ue t ienen c ompetencia i ntra e interespecífica a través de la producción de compuestos bioactivos. Se realizó una selección de 20 organismos en base a fuentes bibliográficas y se hizo una selección de aquellos organismos que presentaron competencia en acuarios experimentales. Una vez seleccionados los organismos de interés, se analizó el efecto antiproliferativo in vitro en tres modelos celulares humanos de cáncer de colon (HGUE-C-1, HT-29 y SW-480). Los cuatros extractos con mayor efecto citotóxico fueron de los nudibránquios Phyllidia varicosa (extracto NA) y Dolabella auricularia (extracto NB), del coral blando Carotalcyon sp (extracto CR) y uno de la holoturia Pseudocolochirus violaceus (extracto PS). Los principales compuestos bioactivos (98 compuestos) representados en estos cuatro extractos se identificaron utilizando un análisis HPLC-ESI-TOF-MS. Entre los compuestos más abundantes caracterizados en cada extracto se encontraron: diterpenos, esteroides, sesqui y sester-terpenos en el extracto CR; cembranólidos e n P S; diterpenos, policétidos e indol terpenos en NA; y se propone que la porfirina, la drimenol ciclohexanona y los esteroides polares de NB, todos ellos fueron los responsables de la actividad observada. Los cuatro extractos mostraron una fuerte capacidad antiproliferativa, mediante un efecto citostático a través de la parada del ciclo celular en la fase G2/M. Mientras que CR, NA y NB indujeron la activación de caspasas y apoptosis, PS promovió la muerte por necrosis sumada a l a apoptótica. Además, los extractos marinos aumentaron las especies reactivas del oxígeno e indujeron estrés oxidativo, desestabilizaron la membrana mitocondrial y dañaron el ADN. En el capítulo 3, se estudió el efecto de los productos naturales marinos como inhibidores de la diana de rapamicina (mTOR) en mamíferos. Esta quinasa es clave en el crecimiento y el metabolismo celular y se encuentra desregulada en muchos tipos de cáncer. Nuestros resultados mostraron evidencias de 11 compuestos puros (seleccionados por acoplamiento molecular y parámetros ADMET calculados) y de dos extractos marinos para inhibir mTOR. Además, extractos marinos y compuestos puros mostraron similitud enFinalmente, en el capítulo 4, la tesis aborda el estudio en profundidad del efecto antiproliferativo del extracto NB mediado por una inducción del estrés oxidativo y endoplásmico en el modelo celular de cáncer de colon humano HCT-116. En primer lugar, encontramos una sobreexpresión de marcadores del estrés del retículo endoplasmático (ER) y una sobreproducción de especies reactivas del oxígeno (del inglés reactive oxygen species, ROS) de forma basal en el modelo de células de cáncer de colon en comparación con las células de colon normales. Esta diferencia en el nivel de estrés basal hizo que las células tumorales fueran más sensibles al extracto NB. Los resultados sugieren que el extracto de NB consigue aumentar considerablemente el estrés celular mediante la inducción de ROS y la sobreexpresión de proteínas relacionadas c on e l e strés d el R E a t ravés d e l a r espuesta a proteínas desplegadas. Además de la capacidad antiproliferativa, se estudió la capacidad de NB para inhibir una de las características más peligrosas de las células tumorales, la capacidad de migración e invasión de modelos superinvasivos procedentes de HCT-116. Los resultados fueron prometedores al mostrar que NB redujo considerablemente la tasa de migración e invasión de las poblaciones más superinvasivas y además se observó que ejercía un menor efecto en la línea no tumoral. Esta tesis, por tanto, demuestra que los compuestos marinos son una fuente potencial de fármacos contra el cáncer ya que ofrecen una diversidad química y actividad biológica amplia. El incremento del número de fármacos de origen marino aprobados, así como el número de estudios científicos en este ámbito corroboran el impacto de este campo en la sociedad actual. Además, esta tesis ofrece resultados interesantes acerca de potenciales antitumorales procedentes de extractos de invertebrados marinos y desvela algunos puntos fuertes de su mecanismo de acción. Asimismo, el presente estudio ofrece resultados de como las nuevas estrategias de cribado computacional que permiten la búsqueda d e compuestos r eguladores d e d ianas claves contra e l cáncer aumentan la efectividad en la búsqueda de compuestos antitumorales. los resultados de inhibición con esta diana.