Análisis de la contribución de los genes MAS2, SMO4 y RRP7 al metabolismo del ARN ribosómico en Arabidopsis thaliana

Abstract

Se considera metabolismo del ARN a cualquier evento en el ciclo de vida de estas moléculas, como su síntesis, plegamiento, procesamiento, modificación y degradación. Una de las facetas más antiguas y complejas del metabolismo del ARN es la biogénesis del ribosoma citoplásmico eucariótico, también llamado ribosoma 80S, en la que intervienen los productos de más de 350 genes, que sintetizan, modifican, ensamblan y transportan unas 80 proteínas ribosómicas (PR) y cuatro ARN ribosómicos (ARNr). Otro aspecto del metabolismo del ARN es el silenciamiento postranscripcional mediado por microARN (miARN), en el que la proteína ARGONAUTE1 (AGO1) juega un papel central en Arabidopsis. Los alelos de insuficiencia de función del gen AGO1 causan un fenotipo pleiotrópico —letal en los casos más severos— que parece deberse a la alteración de numerosos aspectos del desarrollo. En el laboratorio de M.R. Ponce se han identificado alelos hipomorfos y viables de AGO1 y de otros genes de la maquinaria de los miARN, inducidos mediante metanosulfonato de etilo (EMS), uno de los cuales es ago1- 52, portador de una mutación puntual que perturba el splicing de su transcrito primario. ago1-52 fue mutagenizado con EMS en una tesis anterior a esta, con el objetivo de aislar dobles mutantes con fenotipos sinérgicos, que permitiesen identificar genes relacionados funcionalmente con AGO1. El escrutinio de 56.810 semillas M2 nos ha permitido aislar, entre otras, 23 líneas viables en las que el fenotipo morfológico de ago1- 52 se suprime casi totalmente. Hemos denominado morphology of argonaute1-52 suppressed (mas) a las segundas mutaciones de las que son portadoras estas líneas, todas las cuales, salvo una, son supresores extragénicos. Hemos considerado a las mutaciones mas candidatas a ser alelos de genes funcionalmente relacionados con AGO1. Mediante análisis iterativo del ligamiento a marcadores moleculares se identificaron transiciones GA —las mutaciones que con más frecuencia causa el EMS— en los genes AT4G02720 y AT1G80070, a los que hemos denominado MAS2 y MAS5, respectivamente. MAS2 es un gen esencial de copia única que codifica una proteína homóloga de las NKAP (NF-kappa B Activating Proteins) de los metazoos. Hemos demostrado que MAS2 participa en el control de la transcripción del ADNr 45S y el procesamiento de su transcrito primario, cuyos productos finales son los ARNr 25S, 18S y 5.8S. MAS5 es un gen esencial que codifica la proteína PRP8 (PRE-MRNA-PROCESSING SPLICING FACTOR 8) de Arabidopsis. PRP8 es el elemento central del espliceosoma en todos los eucariotas en los que se ha estudiado. La caracterización de MAS5 se completará más adelante. Hemos realizado una búsqueda de interactores de MAS2 basada en el ensayo del doble híbrido de la levadura. Varios de los interactores identificados son ortólogos de proteínas cuya implicación en el control del splicing y en la biogénesis del ribosoma se ha demostrado en otros eucariotas. En esta tesis se han analizado dos de los genes que codifican interactores de MAS2: AT2G40430 y AT5G38720. El ortólogo de AT2G40430 en la levadura codifica la Nucleolar protein 53 (Nop53), que participa en la maduración del pre- ARNr 5.8S y en la biogénesis y exportación del núcleo al citoplasma de la subunidad mayor del ribosoma 80S. AT5G38720 es ortólogo del gen que codifica la Ribosomal RNAprocessing protein 7 (Rrp7) de la levadura, que participa en la maduración del ARNr 18S. Durante el desarrollo de esta Tesis, otros autores han denominado SMALL ORGAN 4 (SMO4) a AT2G40430; hemos llamado RRP7 a AT5G38720. La insuficiencia de función de SMO4 causa un fenotipo similar al de las mutaciones en algunos genes que codifican PR: sus hojas son ligeramente dentadas y apuntadas. Los alelos mutantes de RRP7 alteran la filotaxia y la venación de los órganos laterales, retrasan la floración, reducen la fertilidad y causan hipersensibilidad al ácido abscísico durante el establecimiento de la plántula. Hemos demostrado que SMO4 es una proteína nucleolar y nucleoplásmica y que RRP7 es nucleolar y perinucleolar. En los mutantes smo4 y rrp7 se acumulan intermediarios del procesamiento del pre-ARNr 45S, que indican que SMO4 participa en la maduración de los ARNr 5.8S y 18S, y RRP7 en la del ARNr 18S. Los niveles de las variantes VAR del pre-ARNr 45S están alterados en los mutantes rrp7 y smo4, lo que evidencia la participación de RRP7 y SMO4 en el control, directo o indirecto, de la transcripción del ADNr 45S. Hemos demostrado que rrp7-1 es epistático sobre smo4-3, y que ambos interaccionan con mas2-1 y con alelos hipomorfos o nulos de genes que participan en el procesamiento del pre-ARNr 45S y en la regulación epigenética de la transcripción del ADNr 45S. En conclusión, en esta tesis se han identificado supresores extragénicos de un alelo hipomorfo y viable del gen AGO1 y se ha iniciado la caracterización de uno de ellos, MAS5, que muy probablemente juega un importante papel en el splicing, tal como hacen sus ortólogos en otros eucariotas. También se ha contribuido a la caracterización de otro, MAS2, que regula la transcripción del ADNr 45S y participa en la maduración del pre-ARNr 45S. Se ha confirmado que SMO4 y RRP7 codifican interactores de MAS2 y se ha demostrado a niveles genético, citológico y molecular que estos dos genes están implicados en la biogénesis del ribosoma citoplásmico de Arabidopsis y presentan actividades evolutivamente conservadas a la vez que divergentes. Nuestros resultados sugieren que SMO4 y RRP7 también participan en otras rutas del metabolismo del ARN.