Interaction between Conjugated Polyelectrolytes and Biological Systems: Characterization and Biotechnological Applications

Abstract

Fluorescent conjugated polyelectrolytes (CPEs) display very interesting and useful properties. They are polymers with π-conjugated backbones which show strong absorption and high efficiencies in both photoluminescence and electroluminescence; further they contain ionic side groups to facilitate their water solubilization. These properties have been used to study interactions with biomolecules such as proteins and DNA, allowing to develop sensing platforms and bioimaging tools. In the present Thesis, we characterized two cationic CPEs, with different emission wavelength: blue-emitting HTMA-PFP and red-emitting HTMAPFNT, and we explored their potential use in biotechnological applications. For biomedical applications such as bioimaging, the preliminary condition is the dispersibility of CPEs in aqueous media. Therefore, in the first part of this Thesis, the behaviour of HTMA-PFP and HTMA-PFNT in aqueous solutions was explored. Afterwards, we investigated the interaction of these CPEs with anionic and zwitterionic model membranes in order to use them as fluorescent markers. This study showed that both types of CPEs have higher affinity and selectivity towards anionic lipids, which are the dominant lipid component in bacterial membranes. Taking into account these results, a study by mimicking the mammalian and bacterial membranes with different lipid mixtures was performed and the interaction of these CPEs with both model systems was explored. This study confirmed the selectivity of CPEs, especially HTMA-PFNT, towards bacterial model membranes. Preliminary experiments with living bacteria and mammalian cells supported these results, showing that in samples containing both types of cells, HTMA-PFNT only images the bacterial cells. These results were a proof-of-concept of its use for selective recognition and imaging of bacteria. Moreover, we studied the ability of HTMA-PFP and HTMA-PFNT to form stable fluorescent nanostructures, and we explored their potential applications. Firstly, we investigated the interaction of HTMA-PFNT with two biological systems which are known to be used as nanocarriers: human serum albumin and lipid vesicles. Results showed the formation of red-emitting nanoparticles, preserving the biological functionality. The ability of these nanoparticles to carry hydrophobic and polar compounds was also checked, as well as, the capacity to be used as fluorescent probes for bioimaging. Results supported the potential use of these novel structures as multifunctional platforms for therapeutic and diagnostic purposes. Secondly, the complexation of blue-emitting HTMA-PFP with lipid vesicles was explored. The obtained nanoparticles were characterized and coupled to the enzyme Alkaline Phosphatase to develop a fluorescent biosensor for enzyme inhibitor determination. The components of the biosensor (nanoparticles and enzyme) were immobilized in a sol-gel matrix to facilitate its handling, allowing its reutilization. The biosensor was optimized for the determination of phosphate ion, a competitive inhibitor of the enzyme.

Los polielectrolitos conjugados fluorescentes (CPEs) presentan propiedades muy interesantes. Se trata de polímeros que poseen esqueletos con enlaces π-conjugados y que muestran altos coeficientes de extinción y un elevado rendimiento cuántico de fluorescencia. Además, poseen cadenas laterales que contienen grupos cargados para facilitar su solubilidad en medios acuosos. Estas propiedades pueden ser utilizadas para estudiar interacciones con biomoléculas, tales como proteínas y ADN, con objeto de desarrollar plataformas sensoriales y nuevas herramientas de bioimagen. En la presente Tesis se han caracterizado dos CPEs catiónicos que emiten en diferentes regiones espectrales: HTMA-PFP, con emisión en el azul, y HTMA-PFNT, que emite en el rojo. Además se han explorado sus posibles aplicaciones en el campo de la biotecnología. En aplicaciones biomédicas, como es la bioimagen, un requisito indispensable es la solubilidad del CPE en medio acuoso. Por ello, en la primera parte de esta Tesis se ha explorado el comportamiento de los dos polímeros, HTMA-PFP y HTMA-PFNT, en disolución acuosa. A continuación, se ha investigado la interacción de los CPEs con modelos de membrana formados por lípidos aniónicos y zwitteriónicos, con objeto de evaluar la capacidad de utilizar estos polielectrolitos como marcadores fluorescentes de membrana. Este estudio demostró que ambos compuestos presentan una mayor afinidad y selectividad hacia lípidos aniónicos, que son el componente mayoritario de las membranas bacterianas. Teniendo en cuenta este resultado, se llevó a cabo un estudio en el que se modelizaron membranas de mamífero y bacteriana con diferentes mezclas lipídicas y se exploró cómo interaccionan HTMA-PFP y HTMA-PFNT con estos sistemas. Dicho estudio confirmó la preferencia de los CPEs, especialmente HTMA-PFNT, por los modelos bacterianos. Experimentos preliminares realizados con bacterias y células de mamífero soportaron estos resultados, mostrando que en muestras donde coexisten ambos tipos de células, HTMA-PFNT únicamente marca las células bacterianas. Este experimento evidencia la posible utilización de HTMA-PFNT como una herramienta para el diagnóstico y bioimagen de contaminación bacteriana. Además, se ha estudiado la capacidad de ambos polielectrolitos para formar nanoestructuras fluorescentes estables en medio acuoso y se han explorado sus aplicaciones. Por un lado, se investigó la interacción de HTMA-PFNT con dos sistemas biológicos utilizados frecuentemente como nanotransportadores: la proteína HSA y vesículas liposomales. Así, se obtuvieron nanopartículas que emiten en el rojo y que preservan las propiedades funcionales de los sistemas biológicos que las componen. Estas nanopartículas multifuncionales fueron capaces de transportar compuestos polares e hidrofóbicos y han podido ser utilizadas como sondas fluorescentes en bioimagen. Por otro lado, también se han obtenido nanopartículas fluorescentes que emiten en el azul, a través de la interacción del polielectrolito HTMA-PFP y vesículas liposomales aniónicas. Estas nanopartículas han sido caracterizadas en detalle y acopladas a la enzima fosfatasa alcalina, con objeto de desarrollar un biosensor para la determinación de inhibidores de esta enzima. Los componentes del biosensor (nanopartículas y enzimas) se han inmovilizado en una matriz sol-gel, para facilitar su manipulación y permitir su reutilización. El biosensor ha sido optimizado para la determinación de ion fosfato, un inhibidor competitivo de la enzima.