The roles of GluK4 in amygdala and associated behaviours

Abstract

Kainate receptors (KARs) are a class of ionotropic glutamate receptors ubiquitously present throughout the central nervous system. Mounting evidence indicates the presence of these receptors at both pre- and post-synaptic sides of the synapses. Presynaptically KARs are involved in controlling both inhibitory and excitatory synaptic transmission via the modulation of the release of neurotransmitters like GABA and Glutamate. Postsynaptically, KARs cause membrane depolarisation and mediate postsynaptic responses. KARs have a small contribution to the postsynaptic currents, but they do impart synapses with certain integrative properties and have capabilities to regulate synaptic transmission beyond their role as ion channel forming receptor. GluK1 subunit containing KARs have been found in presynaptic terminals of interneurons and postsynaptically in interneurons and pyramidal cells of the basolateral amygdala (BLA). In this structure, they mediate a fraction of the postsynaptic depolarization, while presynaptically, GluK1 containing KARs in interneurons controls GABA release.Altered glutamatergic neurotransmission is considered to be one of the primary factors contributing to mental diseases such as autism spectral disorders (ASD). The amygdala is involved in emotional behaviours and its relation with some psychiatric illnesses is subject of active research. Alterations in copy number of genes coding for KAR subunits have been linked to neuropsychiatric syndromes such as ASD and bipolar disorders. This is the case of Grik4, a gene coding for a high affinity subunit, GluK4, as de novo duplications of this gene have been described in cases of ASD and schizophrenia. To start delineating the role played by GluK4 containing KARs in brain circuits underlying emotionally relevant behaviours, we followed a gain of function strategy and generated the transgenic mouse C57BL/6J-Tg(Camk2a-grik4), which over-expresses Grik4 in the forebrain under the control of the CaMKII promoter and that was nicknamed GluK4Over. These mice displayed anhedonia, enhanced anxiety and depressive states and impaired social interaction, common endophenotypes associated to ASD. To start looking for functional neural correlates of these abnormal behaviours in amygdala circuits, we studied the effect of Grik4 overexpression on the presynaptic and postsynaptic excitatory activity in identified cells of BLA and Centrolateral amygdala (CeLA). Overexpression of Grik4 led to enhanced spontaneous and external capsule-evoked glutamate excitatory activity in the BLA and consequently increased excitatory inputs to the regular firing cells (RFCs) of CeLA. Overexpressed GluK4 subunits were present both presynaptically and postsynaptically leading to higher release probability of glutamate in cortico-amygdala synapses. In addition to the enhanced probability of release, amplitude was also enhanced in evoked responses mediated by AMPARs in BLA pyramidal cells. Decreased rectification index in these evoked responses mediated by AMPARs in BLA neurons indicated a change in subunit composition of AMPARs, which imposed an increased conductance of postsynaptic AMPARs in BLA pyramidal cells, leading to increased postsynaptic response. In synaptic connections between BLA pyramidal cells and RFCs of CeLA, the probability of release was also enhanced. On the other hand, the probability of release of glutamate and thus excitatory input in synaptic connections between BLA pyramidal cells and late firing cells (LFCs) of CeLA was decreased in GluK4Over mice. A large population of cells in CeLA consists of these LFCs and their activation is known to take part of an anxiolytic circuit. Accordingly, depression of excitatory input to LFCs in GluK4Over mice led to an anxiogenic phenotype in GluK4Over mice. Moreover, in-vivo c-Fos expression studies indicated enhanced resting activity in the BLA and Centromedial amygdala (CeMA) in the GluK4Over mice. Thus overall, depression of activity of late firing cells in the CeLA forming part of the anxiolytic circuit leads to dis-inhibition of CeMA neurons, which further inhibit neurons of downstream targets like Bed Nucleus of the Stria Terminalis (BNST) and Periaqueductal Gray (PAG) and this increased inhibition is known to increase anxiety and fear related behaviour. Finally, we showed that restoring levels of GluK4 protein in GluK4Over mice to normal levels rescue synaptic and behaviour alterations thus indicating excess of GluK4 as the major cause behind increased synaptic gain in anxiogenic circuits provoking aberrant behaviours that are evident in neuropsychiatric diseases like autism and schizophrenia. Taken together, these observations suggest that GluK4 subunit containing high affinity KARs have a significant role in regulating excitatory transmission in the BLA and from BLA to CeLA networks and modest increases in GluK4 protein are associated with increased synaptic gain at selected synapses in the amygdala producing an unbalanced circuit output, which may account for the behavioural abnormalities that concur with diseases such as autism and schizophrenia. Grik4 duplication may be relevant to such disease behaviours in humans given that amygdala is structurally and functionally conserved across species.

Los receptores de kainato (KAR) son una clase de receptores ionotrópicos de glutamato que están presentes de manera ubicua en todo el sistema nervioso central. Las evidencias apuntan a que estos receptores se encuentran tanto en la región presináptica como en la región postsináptica de las neuronas. Presinápticamente, los KAR participan en la modulación de la transmisión sináptica tanto inhibitoria como excitadora a través de la modulación de la liberación de neurotransmisores como GABA y glutamato, e influyen en la maduración de los circuitos neuronales. Postsinápticamente, los KAR causan la despolarización de la membrana y las respuestas postsinápticas. Los KAR tienen una pequeña contribución a las corrientes postsinápticas, pero otorgan ciertas propiedades integradoras a la sinapsis y tienen la capacidad de regular la transmisión sináptica más allá de su función como receptor ionotrópico. Se han encontrado KARs que contienen la subunidad GluK1 en terminales presinápticos de interneuronas y postsinápticamente en interneuronas y células piramidales de la amígdala basolateral (BLA). En esta estructura, estos receptores median una fracción de la despolarización postsináptica, mientras que de manera presináptica, los KARs que contienen GluK1 controlan la excitabilidad a través de la modulación de la liberación de GABA. La alteración de la neurotransmisión glutamatérgica ha sido considerada como uno de los factores principales que contribuyen a enfermedades mentales, como por ejemplo los trastornos del espectro autista (TEA). La amígdala participa en conductas emocionales y su relación con algunas enfermedades psiquiátricas está sujeta a investigación activa. Alteraciones en el número de copias de los genes que codifican las subunidades KARs han sido relacionadas con síndromes neuropsiquiátricos como puede ser el TEA y la depresión. Este es el caso del gen Grik4, un gen que codifica una subunidad de alta afinidad de los KARs, GluK4, cuya duplicación de novo se ha encontrado en casos de TEA. Para comenzar a entender el papel de los KARs que incluyen la subunidad GluK4, en el laboratorio se ha seguido una estrategia de ganancia de función. Generamos una línea transgénica de ratón C57BL / 6J-Tg (Camk2a-grik4), que sobreexpresa Grik4 en el telencéfalo bajo el control del promotor CaMKII y que denominamos GluK4Over. Estos ratones mostraron síntomas de anhedonia y un aumento de la ansiedad lo que conlleva un estado depresivo y un déficit de interacción social, endofenotipos comunes asociados a TEA. Para comenzar a buscar correlaciones funcionales de estos comportamientos anormales con la actividad de los circuitos de la amígdala, estudiamos el efecto de la sobreexpresión de Grik4 sobre la actividad excitadora presináptica y postsináptica en las células características de BLA y de la amígdala centrolateral (CeLA). La sobreexpresión de Grik4 condujo a una mayor actividad excitatoria glutamatérgica tanto espontánea como evocada por la estimulación de la cápsula externa en el BLA y, en consecuencia conllevó un aumento de la entrada excitatoria a las células de disparo regular (RFCs) de CeLA. Las subunidades GluK4 sobreexpresadas están presentes tanto presinápticamente como postsinápticamente, lo que llevó a una mayor probabilidad de liberación de glutamato en las sinapsis cortico-amígdala. Además de la mayor probabilidad de liberación, la amplitud también se incrementó en las respuestas mediadas por AMPARs en las células piramidales de BLA, indicando una mayor conductancia de AMPARs. El índice de rectificación disminuyó en estas respuestas evocadas, lo que indicó un cabio en la composición subunitaria de los AMPARs postsinápticos, que conlleva un incremento en la conductancia unitaria. En las conexiones sinápticas entre las células piramidales BLA y los RFCs de CeLA, la probabilidad de liberación también se incrementó. Por otro parte, la probabilidad de liberación de glutamato y, por lo tanto, la entrada excitadora en las conexiones sinápticas entre las células piramidales BLA y las células de disparo tardío (LFCs) de CeLA se encontraba disminuida en los ratones GluK4Over. Una gran población de células en CeLA consiste en estas LFCs y es conocido que participan en un circuito ansiolítico. En consecuencia, la depresión de la entrada de excitación a las LFCs en ratones GluK4Over condujo a un fenotipo ansiogénico en estos ratones. Además, los estudios de expresión de c-Fos in vivo indicaron en los ratones GluK4Over un aumento en la actividad de reposo en la BLA y en la amígdala centromedial (CeMA), el origen del circuito ansiogénico. Por lo tanto, la depresión de la actividad de las LFCs en el CeLA conduce a la desinhibición de las neuronas CeMA, lo que inhibe aún más las neuronas de conexiones posteriores como puede ser los núcleos de la estría terminal del tálamo (BNST) y la sustancia gris periacueductal (PAG) y esta inhibición aumentada puede ser el origen de la ansiedad y el comportamiento relacionado con el miedo. Finalmente, demostramos que la restauración de los niveles de proteína GluK4 en ratones GluK4Over a niveles normales conduce al rescate de las alteraciones sinápticas y comportamentales, lo que indica el exceso de GluK4 como la causa principal detrás del aumento sináptico en los circuitos ansiogénicos que provocan comportamientos aberrantes que son evidentes en enfermedades neuropsiquiátricas como el autismo y la esquizofrenia. Estas observaciones, tomadas en conjunto, sugieren que los KARs que contienen la subunidad GluK4 de alta afinidad tienen un papel importante en la regulación de la transmisión excitadora en las redes BLA y de BLA a CeLA. La salida desequilibrada del circuito puede explicar las anomalías de comportamiento que coinciden con enfermedades como el autismo y esquizofrenia. La duplicación de Grik4 puede ser relevante para estos comportamientos observados en las enfermedades humanas, dado que la amígdala se conserva estructural y funcionalmente en todas las especies.