Estudio comparativo de dos hidroxiapatitos biológicos utilizados en procesos de elevación de senos maxilares

Abstract

Son muchos los factores que influyen en el resultado de la elevación de suelo de seno maxilar, especialmente la técnica quirúrgica y la selección del material de injerto. Aunque las técnicas de elevación de seno ya han sido ampliamente descritas, los investigadores no han llegado a un acuerdo sobre cuál es el material más apropiado en el uso de esta técnica. La hidroxiapatita es el principal componente inorgánico del hueso natural y se ha aplicado ampliamente en el campo médico como material sustituto óseo gracias a sus excelentes propiedades de bioactividad y biocompatibilidad. Los biomateriales que imitan la estructura y la composición de los tejidos óseos son cruciales en el desarrollo de la regeneración ósea. Las hidroxiapatitas sintéticas son las más utilizadas; sin embargo, no coinciden completamente con la composición química del hueso humano. Afortunadamente, la estructura del tejido del hueso de otras especies es similar a la del hueso humano, y es por eso por lo que durante la última década se ha producido un retorno hacia la hidroxiapatita natural, el material de referencia en esta Tesis Doctoral. La desproteinización es un proceso indispensable para la eliminación de antigenicidad en los senoinjertos de hueso. La temperatura de sintetizado se considera un importante factor que puede alterar las características de la hidroxiapatita. Los parámetros más importantes que pueden afectar las propiedades de la hidroxiapatita son la temperatura y el tiempo de precesado. Por ello, deben estudiarse todos los aspectos relacionados con el material sustitutivo. Parte de la respuesta biológica producida por el biomaterial está condicionada por sus propiedades físicas y químicas. El trabajo expuesto en esta Tesis Doctoral muestra la gran importancia que tiene la completa caracterización de los materiales utilizados. El gran número de alternativas disponibles en contraste con los pocos estudios comparativos hace que la elección del material del injerto se lleve a cabo siguiendo las preferencias del cirujano, y estas no siempre se apoyan en una base científica.Teniendo en cuenta lo anterior, la presente Tesis Doctoral desarrolla un protocolo de caracterización del xenoinjerto y su objetivo es determinar las propiedades fisicoquímicas de dos xenoinjertos desproteinizados a diferente temperatura y cómo estas influyen en el comportamiento in vivo del material.Se utilizaron dos injertos óseos comerciales utilizados en odontología en forma de gránulos, un material PBM no sinterizado, OsteoBiol ® mp3, una hidroxiapaita natural de origen porcino, desproteinizada a baja temperatura (130 ºC); y un material BBM sintetizado, Endobon®, una hidroxiapatita natural de origen bovino desproteinizada a alta temperatura (1200 ºC) ambas caracterizadas antes de su uso en la técnica de levantamiento de seno. Ambos materiales fueron caracterizados en términos de cristalinidad, morfología, porosidad y tamaño de los poros, área de superficie específica, densidad ratio calcio/fosfato en la composición. Las hidroxiapatitas fueron caracterizadas a través de difracción de rayos X, espectrofotómetro de transformada de Fourier (FTIR), picnometría de gas He, porosimetría de mercurio y microscopia electrónica de barrido. Los análisis cuantitativos se hicieron con un sistema de fluorescencia de rayos X por energía dispersiva (EDX). Fueron seleccionados diez pacientes que requerían elevación de seno. El estudio se desarrollo en dos fases quirúrgicas. En la primera de ellas, se llevó a cabo el procedimiento quirúrgico básico en todos los pacientes, un material se colocó en el seno derecho y el otro material en el seno izquierdo, según se determinó de forma aleatoria en un split mouth design. Se hizo un seguimiento clínico y radiológico de los pacientes, que fueron sometidos a CBCT (Cone Bean Computer Tomography) 6 meses después de la cirugía como un método de diagnóstico rutinario. Las imágenes obtenidas se procesaron con el software Image J y la gradación del color térmico se utilizó con la finalidad de observar cambios en la radiopacidad del área injertada. Durante la segunda fase quirúrgica se colocaron los implantes funcionales, tres implantes 3i T3® Implante Certain® Tapered en cada lado, colocados 6 meses después de la elevación de seno. En el momento de la inserción de los implantes, se extrajo una muestra de hueso con una trefina del seno maxilar previamente aumentado, en total, se obtuvieron y enviaron 60 muestras para su análisis histomorfométrico. Las muestras se procesaron para su observación en un microscopio electrónico de barrido con imágenes de electrones retrodispersados (SEM-BSE). El análisis histomosfométrico se llevó a cabo en las muestras de hueso para determinar el contenido de hueso vital, de tejido conectivo y material residual del injerto. Además, el proceso de degradación química de los biomateriales del senoinjerto se analizó utilizando mapas elementales de rayos X en modo de escaneo. Los mapas elementales y los Line Scans permitieron obtener información adicional. El análisis se llevó a cabo en una selección de diferentes puntos de interés tanto del centro como de la periferia de las muestras con el propósito de detectar cambios en los ratios Ca/P. La información se recogió de forma deliberada en puntos de interés estratégicos dentro del biomaterial residual (RB), cercanos y distales al hueso neoformado (NB) y en la superficie de contacto hueso-implante, si la hubiese. Un total de 900 puntos de las 60 biopsias fueron analizados. Tras la inserción de los implantes dentales, se realizó la evaluación de la frecuencia de la resonancia utilizando el Ostell™ Mentor para medir la estabilidad primaria del implante. El valor de la frecuencia de la resonancia se representa a través de un parámetro cuantitativo conocido como ISQ. La medición de los valores ISQ se llevó a cabo durante el procedimiento quirúrgico en el inicio (T1), tres meses después de la cirugía (T2) y 6 meses después de la cirugía (T3). Estos valores se registraron en dirección buco-lingual (B-L) y mesio-distal (M-D) En los resultados de la caracterización de los materiales de hidroxiapatita natural desproteinizados, el análisis de difracción de rayos X reveló la estructura típica de la hidroxiapatita para ambos materiales. Ambos senoinjertos son porosos y muestran poros interconectados. Se observaron importantes diferencias en términos de porosidad, cristalinidad, densidad, área de superficie y composición de ratio calcio/fósforo. El PBM presenta el nivel de porosidad más alto (59,90%); sin embargo, alrededor del cuarenta por ciento (38,11%) de esta porosidad se corresponde con entradas de poro submicrométrico. Por su parte, la porosidad del BBM es de un 49,13% pero presenta una menor proporción de poros submicrométicos, solo el 3,66%. En términos de cristalinidad, los gránulos del PBM presentan baja cristalinidad y el tamaño de los cristales es de 325 nm, mientras que la estructura del material bovino muestra una alta cristalinidad, con un tamaño de los cristales de 732 nm. La mayor densidad se encontró en el BBM, con 2,98 g/cm3 respecto a los 2,85 g/cm3 del PBM. Se observó una mayor área de superficie en el PBM (97,84 m2/g) en comparación con los datos obtenidos del BBM (2,77 m2/g). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la composición del ratio calcio/fósforo del PBM (2.22± 0.08) y la del BBM (2.31±0.09). Aunque la radiopacidad del volumen aumentado se incrementó con el tiempo en ambos materiales, las zonas de control mostraron una mayor densidad de radiopacidad comparadas con las del PBM. La microscopía electrónica de barrido reveló que el hueso neoformado se había adherido a ambas hidroxiapatitas. Las mediciones histomorfométricas de las biopsias de hueso mostraron diferencias estadísticamente significativas. Para el PBM, el hueso neoformado representó el (25,92 ± 1,61%), el material residual del injerto (24.64 ± 0.86%) y el tejido conectivo (49.42 ± 1.62%); por su parte, para el BBM el hueso neoformado representó el (26.83 ± 1.42%), el material residual del injerto, el (30.80 ± 0.88%) y el tejido conectivo no mineralizado, el (42.79 ± 2.88%). En todos los casos, el análisis EDX encontró un descenso significativo del porcentaje del ratio Ca/P en el biomaterial residual con respecto a la composición inicial, mientras que en la interfase se encontró un aumento gradual de los porcentajes de ratio Ca/P, lo que sugiere un aumento en la capacidad osteoconductiva de los materiales y el reemplazo por hueso neoformado en la periferia. El PBM presentó numerosas regiones de reabsorción y un ratio de Ca/P medio de 1,08±0.32 respecto al ratio de Ca/P medio de 1,85±0.34 del BBM. También se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la interfase y en el hueso neoformado entre ambos grupos. Para el PBM, el ratio Ca/P en la interfase fue de 1,93 ± 0,18 y de 2.14 ± 0.08 para el BBM. En el caso de la hueso neoformado, el ratio Ca/P fue de 1.84 ± 0.14 para el PBM y de 2.00 ± 0.08 para el BBM. El Line Scan mostró un aumento de la porosidad dentro del material y una degradación más rápida del PBM en comparación con la observada en el BBM, hecho que está relacionado con la cristalinidad del material. La imagen BSE mostró la reabsorción del injerto PBM en relación con el hueso circundante y material residual en forma de gránulos que consistían en áreas de muy pocas y pequeñas partículas. Todo ello muestra la casi completa reabsorción del PBM de forma similar en el centro y en la periferia de las muestras. De acuerdo con los mapas elementales de rayos X y las imágenes SEM de la interfase entre los implantes de BBM y de PBM y el hueso natural, tanto la zona de reacción como las zonas próximas a esta, estaban compuestas de Ca y P. No se observaron diferencias morfológicas claras entre el hueso neoformado y el hueso viejo en el que se insertaron los implantes. Los valores ISQ medios, en el inicio fueron de 63.8±2.97 para el material sinterizado (BBM) y de 62.6±2.11 para el material no sinterizado (PBM). Los valores ISQ medios a los tres meses fueron de 73.5±4.21 para el BBM y de 67±4.99 para PBM. Los valores ISQ medios a los seis meses fueron de 74.65±2.93 para el BBM y de 72.9±2.63 para PBM. En todos los periodos estudiados se observaron diferencias estadísticamente significativas. Como conclusión general del trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, podemos decir que la información recogida en este estudio muestra el efecto de la temperatura de sintetizado en las propiedades fisicoquímicas de las dos hidroxiapatitas naturales estudiadas y su influencia en el comportamiento biológico de las mismas. Las diferencias encontradas en las características fisicoquímicas de ambos senoinjertos justifican esta distinción en su comportamiento in vivo. Las hidroxiapatitas evaluadas en este estudio demostraron ser biocompatibles y osteoconductivas cuando se utilizan en la elevación de seno maxilar. Se encontró una diferencia significativa en los tiempos de reabsorción y en la estabilidad de los implantes en ambos grupos. La hidroxiapatita no sintetizada de origen bovino con alta porosidad, baja cristalinidad, baja densidad, alta área de superficie y bajo ratio calcio/fósforo presenta un alto ratio de reabsorción pero podría no soportar la presión del seno lo que conllevaría la reneumatización del seno. Por su parte, la hidroxiapatita natural de origen bovino, con una baja porosidad, alta cristalinidad, alta densidad, baja área de superficie y alto ratio calcio/fósforo, presenta una ratio de reabsorción bajo que inhibe la reabsorción del hueso neoformado, tensa la membrana del seno, mantiene el espacio y el suelo del seno maxilar aumentado estable, incrementado la estabilidad primaria del implante y reduciendo el tiempo de carga del implante. La información detallada sobre las características de los materiales de injertos es crucial a la hora de evaluar sus resultados clínicos. La influencia de las propiedades fisicoquímicas de los materiales de injerto óseo en osteointegración se han traducido en periodos de curación más cortos desde la colocación a la reparación. Un conocimiento profundo sobre los diferentes aspectos de las propiedades de los biomateriales y su relación e influencia hacia la regeneración ósea es de crucial importancia.

Several factors will influence the results of grafting the floor of the maxillary sinus, especially surgical techniques and selection of graft material. Although the surgical techniques of sinus lift are well described, researchers have not come to an agreement about which material is the most suitable to sinus augmentation. Hydroxyapatite is the major inorganic component of natural bone and has been applied widely in medical field as bone repair material because of its excellent bioactive and biocompatibility properties. Biomaterials that mimic the structure and composition of bone tissues are important for the development of bone tissue engineering applications. Synthetic hidroxyapatites are the most frequently used but they do not completely match the chemical composition of human bone. Fortunately bones from other species possess a tissue structure similar to that of human bones. During the last decade there has now been a move back to natural hydroxiapatites and has been used as reference material in this PhD thesis. Deproteinization is an indispensable process for the elimination of antigenicity in xenograft bones. The sintering temperature is seen as important factors that could alter the HA´s characteristics. The most important parameters that can affect the properties of HA are the temperature of heat treatment. All aspects of a substitute material must be studied. Part of biological response produced by a biomaterial, is conditioned by their physical and chemical properties. The work reported in this PhD thesis indicates the great importance of full characterization of the materials being used. The large number of alternatives available in contrast with the few comparative studies leaves the choice of the grafting material to the surgeon´s preferences, no always scientifically based. Based on these data, the present PhD thesis developed a protocol for characterization the xenograft. The objetive of this study was to characterize the physicochemical properties of two xenografts deproteinized at different temperature and how the physicochemical properties influence the material performance in vivo. Two commercial bone grafts used in dentistry in the form of granules a non-sintered PBM, OsteoBiol ® mp3 a natural hydroxyapatite of porcine origin, deproteinized at low temperature (130°C) and a sintered BBM, Endobon® a natural hydroxyapatite of bovine origin, deproteinized at high temperature (1200°C) were characterized before being used in sinus lift procedures. Both materials were characterized in terms of crystallinity, morphology, particle size distribution, porosity and pore size, specific surface area, density, and ratio calcium/phosphate in the composition. The hidroxiapatites were characterized thorough powder X-ray diffraction XDR analyses, Fourier transforms infrared spectroscopy FTIR, gas pycnometry, mercury intrusion and scanning electron microscopy SEM. Quantitative analyses were made by an Electronic Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) system. Ten patients were selected who required bilateral sinus augmentation. The study was performed in two surgical phases. In the first phase, the basic surgical procedure was represented in all patients by maxillary sinus floor elevation via a lateral approach, one material was placed in the right sinus and the other in the left sinus, as determined by randomized choice in a split mouth design. The patients were followed up clinical and radiologicaly. All patients underwent CBCT after 6 month of surgery as a routine diagnostic approach. The images obtained were processed by Image J software and color thermal graduation was used to observe the changes in radiopacity in the grafted area. In the second surgical phase the functional implants were placed on each side. Each side received three implants 3i T3® Implante Certain® Tapered placed 6 months after augmentation. A trephine bone core was harvested from the previously elevated maxillary sinus at the moment of implant insertion, 60 bone samples were retrieved and sent for histomorphometric analysis. The specimens were processed for observation under a scanning electron microscope with backscattered electron imaging (SEM-BSE). Histomorphometric analysis was performed on the bone core samples to determine the vital bone, connective tissue, and residual graft material content. In addition the chemistry of the interphases and the chemical degradation process of the xenograft biomaterials were analyzed using X-ray elemental maps in scanning mode. Additional information was obtained from line scans and elemental maps. Analysis was carried out at a selection of different points, taking different points of interest from the middle and from the periphery of the samples to detect changes in Ca/P ratios. Data were then collected from deliberately targeted sites of interest within the residual biomaterial (RB), close to and distal from new bone (NB) and at the bone–implant interface if present. A total of more than 900-point analyses were carried out on the sixty biopsies. After dental implant insertion, the resonance frequency evaluation was performed using the Ostell™ Mentor for measure the primary stability of the implant. The RF value is represented by a quantitative parameter called ISQ. The ISQ values were measured during the surgical procedure (T1- baseline), at 3 months (T2) after surgery and at 6 months (T3) after surgery. The values were recorded for the bucco-lingual (B-L) direction and mesio-distal (M-D) direction. The results of Characterization of Deproteinized Hydroxyapatite Materials show that Xray diffraction analysis revealed typical structure of hydroxylapatite for both materials. Both xenograft are porous and exhibit intraparticle pores. Strong differences were observed in term of porosity, cristallinity, density, surface area, and ratio calcium/phosphate composition. PBM has the greatest porosity (59.90%); however, about forty per cent (38.11%) of this porosity corresponds to submicron pore entrances. BBM porosity was (49,13%) but this exhibit a much smaller proportion of submicron pores, only (3.66%). In term of crystallinity the PBM granules exhibit low crystallinity, crystal size is 325 nm, while BBM structure consisted of a highly crystallinity and the crystal size is 732 nm. Higher density was measured for BBM (2.98 g/cm3) respect (2.85 g/cm3) for the PBM. More surface área were observed for the PBM (97.84) (m2/g) compare to the BBM (2.77 m2/g). Statistically significant difference was found between PBM (2.22± 0.08) and BBM (2.31±0.09) ratio calcium/phosphate composition. Although radiopacity of the augmented volume increased with time for both xenograft materials, the control sites receiving showed a higher density of radiopacity compared with the PBM. Scanning electron microscopy revealed that newly formed bone had become closely attached to both HAs. Histomorphometric measurements on the bone biopsies showed statistically significant differences. For the PBM, the newly formed bone represented (25.92 ± 1.61%), residual graft material (24.64 ± 0.86%) and connective tissue (49.42 ± 1.62%), while for the BBM newly formed bone (26.83 ± 1.42%), residual graft material (30.80 ± 0.88%) and non-mineralized connective tissue (42.79 ± 2.88%).In all cases, EDX analysis found a significant a decrease in the percentage of Ca/P ratio was found in the residual biomaterial, with respect to the initial composition while a gradual increase in the percentages of Ca/P ratio was found at the interface, suggesting an increase in the osteoinductive capacity of the materials and replacement by new bone at its periphery. The PBM showed numerous regions of resorptions, and presented an average Ca/P rate of 1.08±0.32 with respect to the average Ca/P rate 1.85±0.34 of BBM. Statistically significant differences were found too in the interface and in the new bone between the groups. Ca/P ratio in the interface was 1.93 ± 0.18 for the PBMwith respect the 2.14 ± 0.08 of the BBM, and the ratio in the new bone was 1.84 ± 0.14 for the PBM with respect the 2.00 ± 0.08 of the BBM. Line Scan show an increase in the porosity inside the material and a faster degradation of PBM in relation with BBM can be observed, fact that it is related with the crystallinity of the material. BSE image showing the resorbed PBM graft in relation to surrounding bone, granular residual material consisting of areas of very few and smaller particles. These indicated the almost complete resorption of the PBM similarly in the middle, and at the periphery of the samples.According to the elemental X-ray maps and SEM images of the interface between the BBM and PBM implants and the natural bone, the reaction zone was composed of Ca and P phase as well as a short distance away from the reaction zone. There were no obvious morphological differences between the newly formed bone and the old bone into which the implants were inserted. ISQ (Baseline) averaged values were 63.8±2.97 for a sintered BBM, and 62.6±2.11 for a non-sintered PBM. ISQ (Stage 2) average values were 73.5±4.21 for BBM and 67±4.99 for PBM. ISQ (Stage 3) average values were 74.65±2.93 for BBM and, 72.9±2.63 for PBM; differences were statistically significant in all of stages studied. As a general conclusion of the work done in this Doctoral Thesis we can say that the data from this study show the effect of sintering temperature on the physico-chemical properties of Natural HAs and the influence in the biological behavior. The differences found in the physic-chemical characteristics of both xenografts justify this distinct in vivo performance. The HAs assessed in the study were shown to be biocompatible and osteoconductive when used for maxillary sinus elevation. A significant difference in resorption time and in the stability of the implants was found in both groups. The PBM non-sintered hydroxiapatite with high porosity, low cristallinity, low density, high surface area and low calcium/phosphate ratio presents high resorption rate but might not withstand the sinus pressure leading to a repneumatization of the sinus. Whereas the BBM sintered hydroxiapaite with low porosity, high cristallinity, high density, low surface area and high calcium/phosphate ratio presents a slow resorption rate that inhibit the resorption of the newly formed bone, tents the sinus lining, maintains the space, and stablies augmented the maxillary sinus floor increased the early implant stability. Detailed information about graft material characteristics is crucial to evaluate their clinical outcomes. The influence of physic-chemical properties of the bone graft materials on osseointegration has translated to shorter healing times from implant placement to restoration. A sound understanding of various aspects of biomaterial properties and their relation and influence towards bone healing is of utmost importance.