The neuroendocrine control of animal size, body proportion and symmetry

Abstract

Understanding how animals control their size is of fundamental importance in biology and clinical research. It is known that juvenile organisms can adjust their size in response to changes in their environment (plastic response), therefore they produce adults with correct size by counteracting growth anomalies. It is currently unclear exactly how immature animals (including children) compensate these potentially substantial variations in their size. Such compensatory mechanism delays the onset of the reproductive stage of adulthood until a correct size has been reached. This process slows down the growth of normal tissues in order to maintain body and organ proportions within the normal range. However, the neural mechanism of such homeostatic size regulation has yet to be fully defined in any species. In Drosophila, body size is controlled by two prominent neuronal populations: the prothoracicotropic hormone (PTTH)-expressing neurons, which are analogous to the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons in mammals; and the neurons located in the pars intercerebralis (called insulin-producing cells, IPCs) which produce insulin-like peptides and regulate tissue growth, metabolism and developmental timing. Experiments in which the activity of each of these neurons is altered have shown that these neurons operate independently, albeit both regulate maturation time resulting in larger or smaller adults. Thus, it is now apparent that the activity of these neuronal populations operating independently might not be sufficient to explain the reliable size control, which in turn may require more complex or synchronized regulatory circuits.Previous studies have established that the insulin/relaxin-like peptide 8 (Dilp8) controls homeostasis size in Drosophila, although its receptor and site of action remained uncharacterized. In the present thesis proyect, I employed a candidate approach to demonstrate that the orphan relaxin receptor Lgr3 acts as a Dilp8 receptor. Lgr3 receptor is activated by nanomolar concentrations of Dilp8 hormone and results in a robust production of cyclic AMP. Furthemore, using a biochemical readout of Lgr3 response to Dilp8 in vivo, I identified that a pair of neurons acutely respond to Dilp8 signal. I unveiled that these neurons have extensive axonal arborizations (hub-like structure) and connect with both PTTH-producing neurons and the IPCs. Functional relevance of connectivity between Lgr3/PTTH-producing neurons and Lgr3/IPCs were evaluated using several genetical approaches as perturbing neural activity, and/or assessing changes in transcription of genes in postsynaptic targets. Regarding to this, I identified Dilp3 and Dilp5 and the Juvenile hormone signalling as output pathways of this circuit for growth compensation through IPCs. Moreover, I demostrated the ecdysone inhibition through PTTHproducing neurons as output pathway of this circuit for developmental timing regulation. Acordingly with previous studies, the circadian clock regulates the onset of maturation in animals. To clarify the role of circadian clock in Dilp8/lgr3 neural circuit, I characterized the role of the master clock neurons (PDF neurons) and the synaptical connections with Lgr3-positive neurons, and PTTH-producing neurons (where PDF receptor or PDFR is expressed to mediate the function of PDF neuropeptide). I demostrated the Dilp8-Lgr3 homeostatic growth control circuit in collaboration with circadian clock during development has an impact in the lipogenic larval metabolism and adult fitness, providing a better performance upon inanition condictions. In adult female flies, Lgr3-positive neurons are connected synaptically with IPCs, controlling the expression levels of insulin-like peptides 2 and 5 (dilp2 and dilp5). Previous studies have postulated that Dilp2, Dilp3 and Dilp5 could be involve in courtship behaviour and metabolism. Furthemore, the Lgr3-positive neurons have been involved in courtship behaviour. Nevertheless, the activation of Lgr3-positive neurons by Dilp8 do not show impact neither in mating behaviour, nor in the offspring generated. On the other hand, I colaborated with Javier Morante PhD in an independent project to clarify the potential role of Sema1a as a sensor of fat content during development, since this receptor is necessary to detect the critical weight and surpase the juvenile stages to puberty. sema1a depletion in the prothoracic gland allows the larvae to extent the growth period, followed by the inhibition of the ecdysis. The extension of this growth period in sema1a mutants generates as consequences larvae with aberrant lipid content, desproportionate weight, and bigger sizes. Finally, sema1a depletion in the prothoracic gland shows higher insulin and juvenile hormone signalling, disrupting the critical weight detection necessary to promote the ecdysone synthesis.

La comprensión de cómo los animales controlan su tamaño es fundamental en la investigación biológica y clínica. Es conocido que, los organismos en fases juveniles pueden ajustar su tamaño en respuesta a cambios ambientales (respuesta plástica), generando en consecuencia animales de tamaños diferentes (mayores o menores). Actualmente, no está claro como animales en fase de desarrollo (inclusive niños) compensan variaciones sustanciales en el tamaño. Estos mecanismos compensatorios del crecimiento están involucrados en el retraso de la adquisición de los caracteres sexuales para la reproducción de los organismos hasta que el tamaño correcto es adquirido. A su vez, es desconocido como los ratios de crecimiento son mantenidos, a través de los diferentes órganos durante las fases de desarrollo, para el mantenimiento de las proporciones y simetría características de las especies. Sin embargo, los mecanismos neuronales de la regulación homeostática están aún por ser definidos en cualquier especie animal. En Drosophila, el tamaño del cuerpo es controlado por dos poblaciones neuronales: las neuronas productoras del neuropéptido PTTH, las cuales son análogas a las neuronas secretoras de gonadotropina (GnRH) en mamíferos y, que controlan el tiempo de desarrollo, y las neuronas del par intercerebralis (llamadas células productoras de insulina, IPCs), que producen los péptidos de insulina y que regulan el crecimiento de los tejidos, metabolismo y el tiempo de desarrollo. Experimentos en los cuales la actividad neuronal de cada uno de estos tipos de neuronas se altera de forma independiente regula la maduración y crecimiento de los tejidos resultando en adultos de mayor o menor tamaño (respuesta plástica). Por ello, estos fenotipos producidos por las modificaciones de las poblaciones neuronales, explicadas anteriormente, parecen actuar de forma independiente. Por lo tanto, estas neuronas conocidas (neuronas productoras de PTTH y/o las células productoras de péptidos de insulina), que trabajan de manera independiente, no pueden explicar cómo son mantenidos los tamaños finales de las moscas adultas, sus proporciones correctas y el crecimiento sincrónico entre las diferentes partes del cuerpo generando una perfecta simetría bilateral. Estudios previos han establecido que el péptido perteneciente a la familia hormonal de insulina/relaxina Dilp8 controla el tamaño homeostático en Drosophila, aunque su receptor y sitio de acción permanece siendo una incógnita. En la presente tesis doctoral, he desarrollado una aproximación genética con receptores candidatos para demostrar que el receptor Lgr3 actúa como receptor de Dilp8. El receptor Lgr3 se activa en concentraciones nanomolares de la hormona Dilp8, generando un incremento de AMP cíclico. Además, usando genes reporteros en respuesta a la interacción de Dilp8 con Lgr3 in vivo, he identificado un par de neuronas que responden a la señal de Dilp8. A su vez, esta neuronas Lgr3 positivas, extienden sus axones hacia las neuronas productoras del neuropéptido PTTH y las células productoras de insulina. La relevancia funcional de la conexión entre las neuronas Lgr3 y las neuronas productoras del neuropéptido PTTH, y las neuronas Lgr3 con las neuronas productoras de insulina, fue evaluada usando diversas aproximaciones genéticas, como la manipulación de la actividad neuronal y/o por medición de la actividad transcripcional de los genes en las neuronas postsinápticas del circuito que forman las neuronas Lgr3 positivas. De este modo, identifiqué Dilp3 y Dilp5 junto a la señalización de la hormona juvenil como respuesta a la interacción de Dilp8/Lgr3 para compensar el crecimiento desde las células productoras de insulina, y la inhibición de la síntesis de ecdisoma desde las neuronas productoras del neuropéptido PTTH. Por otro lado, previos estudios han demostrado la implicación del ritmo circadiano en la maduración de los organismos. Para poder comprender el papel del ritmo circadiano en el circuito formado por las neuronas Lgr3 positivas con las neuronas productoras de PTTH y las células productoras de péptidos de insulina, caractericé la función de las neuronas que controlan el ciclo circadiano (neuronas PDF). Las neuronas PDF hacen sinapsis con las neuronas Lgr3 positivas, y con las neuronas productoras del neuropéptido PTTH (donde el receptor de PDF o PDFR se expresa para mediar la función del neuropéptido PDF). De este modo he observado que el crecimiento homeostático mediado por Dilp8-Lgr3 en colaboración con el ciclo circadiano, durante el desarrollo, tiene un impacto en el metabolismo de lípidos en las fases juveniles (larva) y en la supervivencia de los individuos adultos bajo condiciones de inanición. Estudios anteriores postulan que, los diferentes péptidos de insulina (Dilp2, Dilp3 y Dilp5), controlan el apareamiento y metabolismo de las moscas de Drosophila. A su vez, otro estudio reciente muestra como las neuronas Lgr3 positivas controlan también el apareamiento. Curiosamente, en hembras adultas, las neuronas Lgr3 positivas siguen conectadas sinápticamente con las células productoras de las insulinas, controlando la transcripción de los péptidos de insulina 2 y 5. Sin embargo, la regulación en la expresión de los péptidos de insulina, a través de la señalización de Dilp8-Lgr3 en las hembras adultas, no tiene ningún impacto en el apareamiento y generación de descendencia por parte de la hembra. Por otro lado, he colaborado con Javier Morante PhD en un proyecto independiente para clarificar el papel de Sema1a como sensor del contenido en grasa durante el desarrollo, indispensable para la detección del peso critico necesario para hacer la transición a la pubertad. La eliminación de sema1a en la glándula protorácica permite a las larvas extender el periodo de crecimiento mediante la inhibición en la producción de ecdisona. La extensión de esta etapa de crecimiento genera como consecuencia la acumulación aberrante de lípidos en la larva, un aumento del peso desproporcionado y mayor tamaño. La eliminación de sema1a muestra una mayor actividad de la vía de señalización de las insulinas y de la hormona juvenil, indicando la pérdida de la detección del peso crítico necesario para la inducción de la síntesis de ecdisona.