Herramientas para el estudio del dolor

Abstract

El dolor es una de las principales patologías del ser humano cuyo tratamiento, en determinadas condiciones, todavía resulta limitado o ineficaz. La percepción del dolor es el resultado de un complejo procesamiento de señales moleculares y bioquímicas en los diferentes niveles del sistema nervioso. La identificación de diferentes proteínas, canales iónicos y receptores, implicados en la conversión de las señales nocivas a potenciales de acción (transducción), ha permitido establecer nuevas dianas terapéuticas para el control del dolor. Entre los canales iónicos responsables de la transducción, destacan algunos miembros de la familia de receptores de potencial transitorio (TRP). Sin embargo, la caracterización de estas dianas ha derivado en un aún restringido número de nuevas terapias analgésicas. La necesidad de ahondar en los mecanismos de regulación de estos canales iónicos para un desarrollo de terapias más eficientes se encuentra con distintos impedimentos instrumentales y metodológicos. Por ejemplo, la falta de sistemas in vitro provoca la dependencia de cultivos celulares primarios. Además, la alta heterogeneidad en las neuronas sensoriales periféricas supone un factor limitante para entender los mecanismos bioquímicos, moleculares y celulares implicados en la sensibilización de los nociceptores por los diferentes compuestos algésicos. En este trabajo se han intentado crear nuevas herramientas in vivo e in vitro que permitan investigar de forma precisa los mecanismos de sensibilización, potenciación, cronificación y/o respuesta a las terapias analgésicas. Dichas herramientas se corresponden, por un lado, con la generación de un modelo animal transgénico que exprese el canal iónico TRPV1 ligado a la proteína fluorescente amarilla (YFP) por el N-terminal del canal. Por otro lado, se ha trabajado en el desarrollo de un modelo celular que permita la obtención en blastocistos. La caracterización de la generación heterocigota se llevó a cabo ante la carencia de una generación homocigota para YFP-TRPV1. Sin embargo, la generación heterocigota no permitió confirmar la expresión de la YFP-TRPV1 ni a través de PCRs en los análisis de tránscritos, ni a través de Western Blot e Inmunocitoquímica en los análisis de expresión de proteína. Los resultados obtenidos muestran la necesidad de continuar investigando el papel de TRPV1 en el desarrollo animal, así como la regulación de su expresión génica, la función de los distintos reordenamientos y las modificaciones post transcripcionales que se producen en el canal y que pudieran estar afectando a la creación del modelo homocigoto. La implementación del uso de nuevas herramientas de modificación genética, tales como CRISPR/Cas9 se llevó a cabo para solventar los problemas de generación del modelo animal. En esta tesis se demuestra cómo, al menos en línea celular, es posible la introducción de una proteína fluorescente en el C-terminal de TRPM8 con la transfección de 2 plásmidos y la selección de clones en un periodo relativamente corto de tiempo. En este sentido, la tecnología CRISPR desarrollada hace carecía de la expresión de marcadores neuronales maduros así como una casi completa falta de respuesta a estímulos inductores de potenciales de acción. Los resultados obtenidos concluyen que esta línea celular podría ser usada en estudios exclusivamente de neurogénesis.

ain is one of the main pathologies in humans, but its treatment, under certain conditions, is still limited or ineffective. The perception of pain is the result of a complex processing of molecular and biochemical signals at different levels of the nervous system. The identification of different proteins, ion channels and receptors, involved in the conversion of harmful signals to action potentials (transduction), has made it possible to establish new therapeutic targets. Among the ion channels responsible for transduction, some members of the transient potential receptors (TRP) family stand out. However, the characterization of these targets has led to a still limited number of new analgesic therapies. However, the need to delve into the mechanisms of regulation of these ion channels for the development of more efficient therapies has different instrumental and methodological restrictions. For example, the lack of in vitro systems leads to dependence on primary cell cultures. Furthermore, the high heterogeneity in peripheral sensory neurons is a limiting factor in understanding the biochemical, molecular and cellular mechanisms involved in the sensitization of nociceptors by different algesic compounds. In this work, we have tried to create new in vivo and in vitro tools that allow us to investigate in a precise way the mechanisms of sensitization, potentiation, chronification and/or response to analgesic therapy. These tools correspond, on the one hand, to the generation of a transgenic animal model, which expresses the TRPV1 ion channel linked to the yellow fluorescent protein (YFP) by the N-terminal of the channel. On the other hand, work has been done on the development of a cellular model that allows obtaining in vitro nociceptors. The development of both tools was accelerated with the implementation of the CRISPR / Cas9 system. For the generation of the animal model, the modification was carried out by homologous recombination of microinjected stem cells in blastocysts. The characterization of the heterozygote generation was realised in the absence of a homozygote generation for YFP-TRPV1. However, the heterozygous generation did not confirm the expression of YFP-TRPV1 either through PCRs in transcripts analysis, or through Western Blot and Immunocytochemistry in protein expression analysis. The results obtained point out the need to continue investigating the role of TRPV1 in animal development, as well as the regulation of its gene expression, the function of the different rearrangements and the post-transcriptional modifications that occur in the channel and that could be affecting to the creation of the homozygous model. The use of new tools for genetic modification, such as CRISPR / Cas9, was performed to solve the problems nimal model. For the development of the cellular model, was used the cell line MED17.11, which is potentially differentiable to adult nociceptors. Nevertheless, the use of this cell line as an in vitro model in pain research is questioned. Despite of the morphological changes observed with the different differentiation protocols applied, the cell line lacked the expression of mature neuronal markers and an almost complete lack of response to stimuli. The results obtained conclude that this cell line could be used in studies exclusively of neurogenesis.