Análisis metagenómico de la microbiota respiratoria en pacientes

Abstract

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), es el proceso respiratorio crónico y progresivo que origina una mayor alteración de la calidad de vida de los pacientes, ingresos hospitalarios y gasto farmacéutico, y supone un problema de salud pública de gran magnitud dada las tasas de morbi-mortalidad. En este proceso, la infección de la vía respiratoria, especialmente durante las exacerbaciones (fase de empeoramiento de los síntomas de esta enfermedad), es una característica fundamental para entender su evolución y pronóstico. Los métodos metodologicos clásicos basados en el cultivo de muestras respiratorias, que aun son los métodos predominantes más utilizados para el diagnóstico infeccioso de esta enfermedad, son herramientas obsoletas a la hora de identificar poblaciones bacterianas tan complejas como las que están presentes en las vías respiratorias de estos pacientes, dado que hay muchos microorganismos que no se pueden aislar por problemas metodológicos, como microorganismos autotróficos, microaerofílicos, anaerobios.... Por este motivo, los tratamientos antibióticos que actualmente se administran se basan en recomendaciones que se han diseñado en base a datos parciales y pueden no recoger la situación real de las necesidades del paciente. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva, al permitir conocer el veradadero microbioma respiratorio en cada tipo de paciente permitirá conocer la patogenia de esta enfermedad y la importancia del componente infeccioso en la misma, así como diseñar mejor los protocolos de la terapia empírica, permitiendo adecuar los tratamientos de los pacientes a la realidad para mejorar la eficacia de los mismos. El objetivo de este trabajo es comparar el microbioma de la mucosa respiratoria en dos grupos de pacientes estables con COPD: leves-moderados versus graves muy graves mediante dos metodologías: caracterización de la composición de microbioma bacteriano mediante pirosecuenciación del gen ribosómico 16S y cuantificación de la carga bacteriana total presente en estos dos grupos de pacientes medida mediante qPCR, y su comapración con el cultivo cuantitativo (método tradicional) Para identificar la diversidad bacteriana (microbiota) en el esputo expectorado, se realizó un método de pirosecuenciación que investiga comunidades microbianas complejas de esputo expectorado en 19 pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica estable (media (DE) FEV1: 47 (18%) del valor predicho ). Utilizando el cultivo convencional, se identificaron 3 géneros de filas y 20 bacterias, mientras que el método de pirosequenciación detectó 9 phyla y 43 géneros (p <0,001). En el esputo, los géneros predominantes con el método de pirosecuenciación fueron Streptococcus, Actinomyces, Neisseria, Haemophilus, Rothia, Fusobacterium, Gemella, Granulicatella, Porphyromonas, Prevotella y Veillonella. Las Enterobacteriaceae, detectadas frecuentemente en cultivo convencional, no se detectaron significativamente con los métodos de pirosecuenciación. Además, se encontró que los patógenos importantes como Haemophilus y Moraxella se detectaron con más frecuencia con los nuevos procedimientos genéticos. La presencia de Enterobacteriaceae está probablemente sobreestimada con el cultivo convencional, mientras que otros patógenos difíciles de cultivar están subestimados. Por otro lado, tras analizar bioinformáticamente con qiime, los datos obtenidos por pirosecuenciación, nuestros datos muestras una mayor biodiversidad en los pacientes leves-modcerados respecto a los graves-muy graves (Shannon index 4.5 von una media de 13 géneros por muestra versus Shannon index 3.1, una media de 7 géneros por muestra) (p = 0.041 by U Mann-Whitney test). Además, nuestros datos muestran que el grupo de pacientes graves-muy graves presentaban una carga bacteriana ligeramente superior (4,200 vs 5,000 copias 16S / cél humana). También destacamos la importante asociación entre la presencia de Actynomices y la gravedad del proceso, ya que este microorganismo está presente en pacientes leves-moderados (8/9) mientras que es menos probable encontrarlo formando parte de la microbiota de pacientes severos (2/10) (p = 0.01, by ANOVA test)

Por tanto las técnicas metagénomicas como la pirosecuenciación, abren una nueva perspectiva para evaluar el papel de la colonización bacteriana en la patogénesis y progresión de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, nuestros datos muestran las importantes diferencias entre el microbioma de la flora respiratoria de los pacientes con COPD con diferente grado de gravedad y puede ser la base para conocer mejor este complejo proceso, con objeto de instaurar medidas diagnósticas y terapéuticas adecuadas en base a estas nuevas metodologías, claramente superiores a los métodos basados en cultivo microbiológico tradicional