Impact of intratumoral EMT heterogeneity on breast cancer progression

Abstract

Despite notable progress in cancer therapies that have prolonged median survival, metastatic relapse remains the leading cause of cancer-related mortality. Metastasis is a complex, multistep process only activated in a minority of cancer cells. Its timing is markedly heterogeneous, some patients present with metastases at diagnosis, whereas in others, secondary lesions emerge years after initial treatment. Recent discoveries have advanced our understanding of the determinants of metastatic competence. Nonetheless, most studies emphasize the role of the metastatic microenvironment, leaving the contribution of cancer cell-intrinsic states upon arrival largely unexplored. In this thesis, through the analysis of human breast cancer samples, preclinical in vivo models, and culture systems, we demonstrate that (i) cancer cells depart the primary tumor with a pre-established metastatic potential, and (ii) metastatic outgrowths recapitulate the epithelial–mesenchymal transition (EMT) hierarchies observed in the primary tumor. Specifically, the integration of spatial and single-cell transcriptomics plus chromatin accessibility data reveals that the plasticity factor Prrx1 is a central regulator of metastatic potential. Beyond its established role in promoting invasion, Prrx1 suppresses proliferation by modulating the expression of cell cycle regulators (Ccnd1/2, Cdkn2a/b/c) and induces a dormancy program through targets such as Gas6, Mme, and Ogn. Importantly, intermediate levels of Prrx1 achieve a critical balance between invasiveness and proliferation, resulting in a hormetic (non-linear) relationship between its expression and metastatic burden. As such, Prrx1 expression within the primary tumor emerges as a determinant of metastatic competence, and its intratumoral heterogeneity provides a framework to understand why some invasive cancer cells enter dormancy while others continue to grow at distant tissues. In addition, analysis of the EMT status across the primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions in spontaneous metastatic breast cancer mouse models confirmed the EMT origin of disseminating cells and revealed their high plasticity potential. Despite exhibiting an active, embryonic-like EMT program, metastatic cells retain the ability to recreate the distribution between embryonic and adult-like EMT programs, observed in the primary tumor. Finally, we show that the combined expression of invasion and proliferation gene signatures enables robust prognostic stratification of breast cancer patients, underscoring the clinical significance of this phenotypic axis. /A pesar del avance en terapias oncológicas que han mejorado la supervivencia, la metástasis sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer. Este proceso, altamente complejo y compuesto por múltiples etapas, solo se activa en una minoría de células tumorales. Su dinámica temporal es muy heterogénea: mientras algunos pacientes presentan metástasis desde el diagnóstico, en otros, éstas aparecen años después del tratamiento inicial. El avance de los últimos años en la identificación de factores que determinan la capacidad metastásica se ha centrado fundamentalmente en el microambiente metastático. Aquí hemos explorado en profundidad la contribución de las propiedades intrínsecas de las células tumorales que consiguen metastatizar. Mediante el análisis de muestras de pacientes con cáncer de mama, modelos preclínicos in vivo y sistemas celulares, demostramos que (i) las células tumorales abandonan el tumor primario con una capacidad metastásica ya establecida, y (ii) que las metástasis reproducen los distintos estados celulares controlados por la transición epitelio-mesénquima (EMT) observada en el tumor primario. La integración de datos de transcriptómica y de su distribución espacial, junto con la accesibilidad cromatínica todos ellos analizados en miles de células únicas identifica al factor de transcripción Prrx1 como un regulador clave de la diseminación metastásica. Además de su papel conocido en la invasión, Prrx1 inhibe la proliferación mediante la regulación de genes del ciclo celular (Ccnd1/2, Cdkn2a/b/c) e induce un programa de letargo a través de genes como Gas6, Mme y Ogn. Niveles intermedios de Prrx1 permiten un equilibrio crítico entre invasión y proliferación, estableciendo una relación hormética entre su expresión y la carga metastásica. Así, su expresión en el tumor primario emerge como un determinante de su potencial metastásico, y su heterogeneidad intratumoral proporciona un marco conceptual para entender por qué ciertas células invasivas entran en letargo mientras otras proliferan en órganos distantes. Asimismo, el análisis de estados EMT en tumores primarios, células tumorales circulantes y metástasis en modelos murinos confirma el origen EMT de las células invasivas y revela una notable plasticidad. Aunque adoptan un programa pseudo-embrionario para desprenderse del tumor primario, conservan la capacidad de reproducir en las metástasis la misma distribución de estados EMT y por tanto, de heterogeneidad intrametastásica. Finalmente, demostramos que la combinación de firmas genéticas de invasión y proliferación permite estratificar de forma robusta el pronóstico de pacientes, evidenciando la relevancia clínica del equilibrio entre estas dos propiedades