Estrategias funcionales para favorecer la osteogénesis y angiogénesis en andamios vitrocerámicos multicapa dopados iónicamente

Abstract

El tejido óseo posee una notable capacidad de autorregeneración, lo que le permite reparar lesiones y adaptarse a las demandas mecánicas. Sin embargo, dicha capacidad puede verse comprometida por factores como el envejecimiento o la presencia de enfermedades concomitantes. El tratamiento habitual de estas lesiones se basa en la aplicación de injertos óseos, siendo especialmente relevantes los de naturaleza cerámica debido a su baja inmunogenicidad, alta disponibilidad y similitud con la fase mineral del hueso. No obstante, aún no se ha logrado desarrollar un injerto que combine, de forma simultánea, las propiedades químicas, mineralógicas, físicas y biológicas necesarias para garantizar la eficacia del implante a largo plazo. En este contexto, la presente Tesis Doctoral plantea el diseño y desarrollo de andamios multicapa, concebidos para combinar fases con propiedades complementarias que permitan satisfacer dichos requisitos. Para ello, se formularon andamios que integran en una única estructura las fases CaSiO₃, Ca₂P₆O₁₇ y Ca₃(PO₄)₂. Las técnicas empleadas para la obtención de dichos andamios fueron el proceso sol-gel y la técnica de réplica de esponja polimérica. Los andamios desarrollados presentaron una estructura policristalina, con un núcleo compuesto por SiO₂ y cristales de Ca₂P₂O₇ embebidos en una matriz vítrea. Por otro lado, los recubrimientos externos proporcionaron fases bioactivas y reabsorbibles, como CS, β-TCP, whitlockita y akermanita. Respecto a las propiedades físicas, los andamios mostraron una resistencia mecánica en el rango de 1.8–2 MPa y una porosidad total cercana al 85%, valores alineados con las propiedades del hueso trabecular. Además, considerando el potencial del dopaje iónico para modular las propiedades de los materiales, y el papel de los iones en la regulación de procesos celulares clave, se incorporó Li en la fase P6, y se dopó el recubrimiento externo de CS con Na, K, y cantidades variables de Mg (0-0,75 g MgCO₃). La cantidad de Mg introducida como dopante no afectó significativamente a la porosidad o resistencia mecánica, sin embargo, moduló el comportamiento bioactivo y la microestructura de los andamios CSX. Durante los ensayos de bioactividad, se determinó que cantidades de MgCO₃ entre 0,4 g (CS04) y 0,5 g (CS05) optimizaron la formación de apatito, promoviendo un precipitado temprano y sostenido a lo largo de los 21 días de estudio. En particular, el andamio CS04 presentó una microestructura lamelar, que fue recubierta progresivamente por precipitado de apatito hasta quedar completamente cubierta en el día 14. Por su parte, el andamio CS05 exhibió una superficie heterogénea, caracterizada por la presencia de estructuras granulares y abastonadas. Sobre esta superficie, se desarrolló un precipitado que experimentó una evolución desde estructuras entrelazadas (día 1) hacia una morfología poliédrica (día 3) y, posteriormente, microesferas huecas de apatita (día 7) que se mantuvieron hasta el día 14. La formación de estas microesferas se atribuye al mecanismo de maduración de Ostwald, favorecido por la elevada densidad de carga superficial inducida por el dopaje con Mg. Desde una perspectiva funcional, la topografía lamelar destaca por su biomimetismo estructural, mientras que las microesferas representan una plataforma prometedora para la liberación controlada de fármacos o agentes bioactivos. Una vez realizados los ensayos de bioactividad, se procedió a evaluar la biocompatibilidad de los andamios CS0 (control), CS04 y CS05, en líneas celulares murinas (fibroblastos 3T3 y preosteoblastos MC3T3-E1) y humanas (fibroblastos HFF1 y células madre mesenquimales). Concretamente se evaluó la citocompatibilidad, el potencial osteogénico indirecto de los andamios mediante la exposición de MSCs a los productos de disolución, así como el potencial osteogénico directo en MC3T3-E1. Asimismo, se valoró el potencial angiogénico mediante la cuantificación de VEGF en sobrenadantes celulares de MC3T3-E1. Adicionalmente, se comparó la proliferación de fibroblastos 3T3 sembrados sobre las diferentes topografías exhibidas por CS04 y CS05 antes y después de los ensayos de bioactividad. Todos los andamios mostraron una citocompatibilidad adecuada, reflejada en una proliferación celular sostenida tanto en el enfoque directo como en el indirecto, una morfología fenotípicamente conservada y una interacción célula-andamio robusta. El análisis de los productos de disolución reveló una liberación predominante de silicio y litio, elementos implicados en la activación de rutas osteogénicas y angiogénicas, especialmente la vía Wnt. Asimismo, se determinó que las modificaciones topográficas inducidas por el Mg, tanto el patrón lamelar de CS04, en particular su variante recubierta por apatito, como las microesferas huecas observadas en CS05, favorecieron una mayor proliferación celular respecto al resto de morfologías. En cuanto al potencial osteogénico, los ensayos en MSCs demostraron que los productos de disolución liberados por los andamios promovieron una mayor diferenciación osteoblástica tras 21 días, como se refleja en el aumento de la expresión de ALP y en una mayor mineralización respecto al control. De forma similar, en los ensayos directos, los preosteoblastos MC3T3-E1 cultivados sobre los andamios presentaron una actividad osteogénica superior, con una mayor deposición de calcio y una actividad específica de ALP incrementada respecto al control tras 21 días. Estos efectos fueron ligeramente más acentuados en el andamio CS04, lo que se atribuye a su topografía lamelar biomimética. En cuanto al potencial angiogénico, se registró un aumento del 170% en la liberación de VEGF en los sobrenadantes celulares de MC3T3-E1, lo cual, junto con la elevada porosidad de los andamios, refuerza su idoneidad como soporte estructural para la vascularización tisular. En conclusión, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado andamios bioactivos de tercera generación, con diseño multicapa y degradación controlada, capaces de liberar iones osteo- y angiogénicos de forma sostenida. Su elevada porosidad, topografías biomimeticas y dopaje iónico les confieren un comportamiento bioactivo avanzado, presentándose como candidatos prometedores en ITO.

Bone tissue possesses a remarkable capacity for self-regeneration, allowing it to repair injuries and adapt to mechanical demands. However, this capacity can be compromised by factors such as ageing or the presence of concomitant diseases. The usual treatment for such lesions is based on the application of bone grafts, with those of a ceramic nature being particularly relevant due to their low immunogenicity, high availability and similarity to the mineral phase of bone. However, the development of a graft that combines the chemical, mineralogical, physical and biological properties necessary to guarantee the long-term efficacy of the implant has not yet been achieved. In this context, this Doctoral Thesis proposes the design and development of multilayer scaffolds, conceived to combine phases with complementary properties to meet these requirements. In order to achieve this objective, scaffolds integrating CaSiO₃, Ca₂P₆O₁₇ and Ca₃(PO₄)₂ phases into a single structure were formulated. The techniques used to obtain these scaffolds were the sol-gel process and the polymer sponge replication technique. The developed scaffolds exhibited a polycrystalline structure, with a core composed of SiO₂ and Ca₂P₂O₇ crystals embedded in a glassy matrix. Conversely, external coatings provided bioactive and resorbable phases, such as CS, β-TCP, whitlockite and akermanite. Regarding physical properties, the scaffolds demonstrated a mechanical strength within the range of 1.8–2 MPa, and a total porosity close to 85%, values aligned with the properties of trabecular bone. Furthermore, considering the potential of ion doping to modulate material properties, and the role of ions in regulating key cellular processes, Li was incorporated into the P6 phase, and the outer CS coating was doped with Na, K, and varying amounts of Mg (0-0.75 g MgCO₃). The amount of Mg introduced as a dopant did not significantly affect the porosity or mechanical strength, however, it was found to modulate the bioactive behaviour and microstructure of the CSX scaffolds. During the bioactivity tests, it was determined that amounts of MgCO₃ between 0.4 g (CS04) and 0.5 g (CS05) optimised apatite formation, promoting early and sustained precipitation throughout the 21-day study. In particular, the CS04 scaffold exhibited a lamellar microstructure, which was progressively covered by apatite precipitate until it was completely covered by day 14. Conversely, scaffold CS05 exhibited a heterogeneous surface, characterised by the presence of granular and abased structures. On this surface, a precipitate developed and evolved from interlocking structures (day 1) to a polyhedral morphology (day 3) and, subsequently, hollow apatite microspheres (day 7) that were maintained until day 14. The formation of these microspheres is attributed to the Ostwald maturation mechanism, which is favoured by the high surface charge density induced by Mg doping. From a functional perspective, the lamellar topography stands out for its structural biomimicry, while the microspheres represent a promising platform for the controlled release of drugs or bioactive agents. Once the bioactivity assays were performed, the biocompatibility of the CS0 (control), CS04 and CS05 scaffolds was evaluated in murine (3T3 fibroblasts and MC3T3-E1 preosteoblasts) and human (HFF1 fibroblasts and mesenchymal stem cells) lines. Specifically, the cytocompatibility, the indirect osteogenic potential, assessed by exposing MSCs to the dissolution products, as well as the direct osteogenic potential in MC3T3-E1 were assessed. Furthermore, angiogenic potential was evaluated by quantification of VEGF release in MC3T3-E1 cell supernatants. Additionally, the proliferation of 3T3 fibroblasts seeded on the different topographies exhibited by CS04 and CS05 before and after bioactivity assays was compared. All scaffolds demonstrated adequate cytocompatibility, reflected in sustained cell proliferation in both direct and indirect approaches, phenotypically conserved morphology and robust cell-scaffold interaction. The analysis of the dissolution products revealed a predominant release of silicon and lithium, elements involved in the activation of osteogenic and angiogenic pathways, especially the Wnt pathway. It was also determined that the topographical modifications induced by Mg, both the lamellar pattern of CS04, in particular its apatite-coated variant, and the hollow microspheres observed in CS05, favoured a higher cell proliferation than the other morphologies. In terms of osteogenic potential, assays on MSCs demonstrated that the dissolution products released by the scaffolds promoted increased osteoblast differentiation after 21 days, as reflected by increased ALP expression and increased mineralisation compared to the control. Similarly, in direct assays, MC3T3-E1 preosteoblasts cultured on the scaffolds exhibited superior osteogenic activity, with increased calcium deposition and increased ALP-specific activity relative to the control after 21 days. These effects were slightly more pronounced in the CS04 scaffold, which is attributed to its biomimetic lamellar topography. Regarding the angiogenic potential, there was a 170% increase in VEGF release in MC3T3-E1 cell supernatants, which, together with the high porosity of the scaffolds, reinforces their suitability as a structural support for tissue vascularisation. In conclusion, this Doctoral Thesis has developed third generation bioactive scaffolds, with multilayer design and controlled degradation, capable of releasing osteo- and angiogenic ions in a sustained manner. Their high porosity, biomimetic topographies and ionic doping confer them an advanced bioactive behaviour, presenting them as promising candidates in ITO.