Empleo de la enzima N-acetil-β-Dglucosaminidasa para la detección de mamitis en ovejas lecheras

Abstract

Las mamitis, son a día de hoy, uno de los mayores problemas para la producción ovina de leche, siendo la infección intramamaria su principal causa. Por un lado, provocan graves pérdidas económicas como consecuencia de una menor producción y rendimiento de la leche, de la pérdida de animales afectados, de los costes del tratamiento y de las pérdidas de leche no considerada apta para el consumo. Por otro lado, suponen un riesgo sanitario debido al consumo de productos lácteos contaminados por algunas bacterias. Y, por último, también causan un problema a nivel de bienestar animal, por el dolor que esta enfermedad puede llegar a provocar. Por lo tanto, el estudio y puesta a punto de nuevos métodos indirectos de detección de mamitis a nivel de granja es un tema de gran relevancia, ya que ayudarán a monitorizar la enfermedad y agilizar la toma de decisiones sobre el tratamiento del animal afectado y el destino de la leche. La N-acetil-β-D-glucosaminidasa (NAGasa) es una enzima que se encuentra principalmente en los leucocitos y en las células epiteliales secretoras de leche. Durante la mamitis, como resultado del proceso inflamatorio, se producen cambios en las membranas de las células y en la permeabilidad de los vasos, por lo que la NAGasa es liberada a la leche, y sus niveles se elevan durante la enfermedad. Hay estudios que apuntan, que la NAGasa podría resultar un buen indicador para la detección de la mamitis de forma automática durante el ordeño, dado el avance tecnológico conseguido en biosensores en los últimos años. Por todo esto, el objetivo de esta tesis doctoral, fue analizar el efecto de determinados factores de variación sobre la NAGasa y comprobar si es posible usar esta enzima como método de detección teniendo en cuenta la variabilidad producida por los mismos. Para ello se realizaron dos estudios en ovejas de raza Manchega de la Granja de pequeños rumiantes de la Universidad Miguel Hernández de Elche, en el primero de ellos se observó de manera específica cómo afectaba la infección intramamaria (IMI) y otros los factores no infecciosos (estado de lactación, número de parto, ordeño) sobre la actividad de la enzima en la leche. En el segundo, se investigó el efecto de la instauración de la IMI sobre los valores de la enzima a lo largo de varias semanas, junto con el resto de efectos, comparándolo con animales que permanecieron libres de IMI. En ambos estudios, se analizó la capacidad predictiva de la enzima mediante el uso de distintos algoritmos. Los resultados mostraron que los factores no infecciosos estudiados, como el estado de lactación, el número de partos y el turno de ordeño, tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre los valores de NAGasa (p < 0,05). Los valores más altos se encontraron al inicio y al final de la lactación, en el ordeño de la mañana y en las glándulas de hembras multíparas que presentaban IMI. El estado de salud de la glándula fue el factor que provocó la mayor variación en los niveles de la enzima, mostrando las glándulas con IMI valores más altos que las glándulas sanas. Además, los resultados indicaron que, en las glándulas infectadas, se produjo un aumento muy marcado de los niveles de la enzima en los 4 días que siguieron a la instauración de la infección (51,57 vs 105,69 μM/min por mL). El estudio de la capacidad predictiva de la enzima mediante el uso de diversos algoritmos, reveló una gran eficacia de la misma. En el primer estudio, se observó que, en el caso de priorizar la sensibilidad, el algoritmo que obtuvo un mejor resultado fue el modelo que incluía NAGasa junto con el estado de lactación y el número de partos, obteniendo una capacidad predictiva de 0,80, una precisión del 70%, una sensibilidad del 73% y una especificidad del 70%. En caso de priorizar la especificidad, el modelo que incluía NAGasa, el estado de lactación, el número de partos y el ordeño fue el que mejor predijo el estado de salud de la glándula mamaria, obteniendo una capacidad predictiva de 0,80, una precisión del 77%, una sensibilidad del 64% y una especificidad del 79%. En el segundo estudio, el modelo que mostró mejores resultados al priorizar la sensibilidad, fue el que identificó en un mínimo de dos días dentro de los cuatro inmediatamente posteriores a la aparición de la infección, un incremento superior al 30% en los niveles de NAGasa, en comparación con la media de los tres días previos a la infección, obteniendo una capacidad predictiva de 0,90, una precisión del 89,8%, una sensibilidad del 95,2% y una especificidad del 85,7%. Al priorizar la especificidad, el mejor modelo fue el que utilizó la misma regla, pero en un mínimo de tres días en lugar de dos, obteniendo una capacidad predictiva de 0,87, una precisión del 87,8%, una sensibilidad del 81% y una especificidad del 92,9%. Se concluyó que la mamitis afecta a los niveles de la NAGasa (obteniendo los mayores valores las glándulas con mamitis infecciosa), juntamente con otros factores no infecciosos como el estado de lactación, el número de parto o la sesión de ordeño, existiendo una correlación positiva y significativa con el RCS. Al aplicar diferentes algoritmos que incluían la medición diaria de la enzima, se observó que la NAGasa es capaz de detectar la infección de la glándula mamaria dentro de los primeros 4 días después de la instauración de la infección. Esta rápida detección puede permitir reducir las pérdidas económicas, la severidad de la enfermedad y aumentar el bienestar animal. Varios de los algoritmos estudiados pueden resultar útiles para la detección de la mamitis ya que presentan una capacidad predictiva y precisión altas, así como de sensibilidad y especificidad. La elección del algoritmo dependerá de las necesidades de las explotaciones en función de si necesitan priorizar la especificidad o la sensibilidad.

Mastitis is currently one of the biggest problems for dairy sheep production, with intramammary infection being its main cause. On the one hand, it causes serious economic losses due to reduced milk production and yield, the loss of affected animals, treatment costs, and the loss of milk not considered suitable for consumption. On the other hand, it poses a health risk due to the consumption of milk contaminated by certain bacteria. Finally, it also poses an animal welfare problem due to the pain this disease can cause. Therefore, the study and development of new indirect methods for detecting mastitis at the farm level is of great importance, as they will help monitor the disease and streamline decision-making regarding the treatment of affected animals and the disposal of the milk. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) is an enzyme found primarily in leukocytes and milk-secreting epithelial cells. During mastitis, as a result of the inflammatory process, changes occur in cell membranes and vascular permeability, causing NAGase to be released into the milk, and its levels rise during the disease. Some studies suggest that NAGase could be a good indicator for the automatic detection of mastitis during milking, given the technological advances achieved in biosensors in recent years. Therefore, the objective of this doctoral thesis was to analyze the effect of certain variation factors on NAGase and to determine whether it is possible to use this enzyme as a detection method, taking into account the variability produced by these factors. To this end, two studies were conducted on Manchega sheep at the Small Ruminant Farm of the Miguel Hernández University in Elche. The first specifically observed how intramammary infection (IMI) and other non-infectious factors (lactation status, parity, milking) affected the enzyme's activity in milk. In the second study, the effect of IM administration on enzyme levels was investigated over several weeks, along with other effects, compared with animals that remained IMI-free. In both studies, the enzyme's predictive capacity was analyzed using different algorithms. The results showed that non-infectious factors studied, such as lactation stage, parity, and milking session, had a statistically significant effect on NAGase levels (p < 0.05). The highest values were found at the beginning and end of lactation, during morning milking, and in the glands of multiparous females with IMI. Gland health was the factor that caused the greatest variation in enzyme levels, with glands with IMI showing higher values than healthy glands. Furthermore, the results indicated that, in infected glands, there was a marked increase in enzyme levels in the 4 days following the onset of infection (51.57 vs. 105.69 μM/min per mL). The study of the enzyme's predictive capacity using various algorithms revealed its high predictive efficacy. In the first study, it was observed that when prioritizing sensitivity, the algorithm that obtained the best result was the model that included NAGase along with lactation stage and parity, obtaining a predictive capacity of 0.80, an accuracy of 70%, a sensitivity of 73%, and a specificity of 70%. While in case of prioritizing specificity, the model that included NAGase, lactation stage, parity, and milking was the one that best predicted mammary gland health, obtaining a predictive capacity of 0.80, an accuracy of 77%, a sensitivity of 64%, and a specificity of 79%. In the second study, the model that showed the best results when prioritizing sensitivity, was the one that identified, within a minimum of two days within the four immediately following the onset of infection, an increase greater than 30% in NAGase levels, compared to the average of the three days prior to infection, obtaining a predictive capacity of 0.90, an accuracy of 89.8%, a sensitivity of 95.2%, and a specificity of 85.7%. When prioritizing specificity, the best model was the one that used the same rule but with a minimum of three days instead of two, obtaining a predictive capacity of 0.87, an accuracy of 87.8%, a sensitivity of 81%, and a specificity of 92.9%. It was concluded that mastitis affects NAGase levels (with the highest values in glands with infectious mastitis), along with other non-infectious factors such as lactation stage, parity and milking session, with a positive and significant correlation with SCC. When applying different algorithms that included daily measurement of the enzyme, it was observed that NAGase is capable of detecting mammary gland infection within the first 4 days after the onset of infection. This rapid detection can reduce economic losses and disease severity, and increase animal welfare. Several of the algorithms studied may be useful for detecting mastitis, as they exhibit high predictive capacity and accuracy, as well as sensitivity and specificity. The choice of algorithm will depend on the needs of the farms, depending on whether they prioritize specificity or sensitivity