A novel dental stem cell-based in vitro model for X-linked adrenoleukodystrophy: From development to therapeutic strategies

Abstract

X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare genetic disorder caused by mutations in the ABCD1 gene. This gene encodes the adrenoleukodystrophy protein (ALDP), a crucial peroxisomal membrane protein responsible for transporting very long-chain fatty acids (VLCFAs) into peroxisomes, where these fatty acids are broken down. In X-ALD, mutations in ABCD1 lead to a malfunction in ALDP, resulting in the accumulation of VLCFAs in the body, particularly in the nervous system and adrenal tissues. This accumulation causes a spectrum of clinical manifestations that range from adrenal insufficiency to severe neurodegenerative symptoms, including inflammatory demyelination of the central nervous system, leading to debilitating and often fatal outcomes. The complexity and variability of symptoms, alongside limited therapeutic options, make X-ALD particularly challenging to treat, especially for patients with the most severe forms of the disease. One of the primary obstacles in understanding X-ALD's underlying mechanisms and developing targeted treatments is the absence of effective animal models that accurately mimic the demyelination process observed in humans. As a result, researchers have turned to human cell-based models to study the disease. In this Doctoral Thesis, we sought to advance the understanding of X-ALD through the development of a novel in vitro model using human dental pulp stem cells (hDPSCs) derived from an affected patient. These cells provide a unique and clinically relevant model, as they express the ALDP protein similarly to cells from healthy individuals, but exhibit abnormal neutral lipid accumulation, reflecting the dysfunction of ALDP seen in X-ALD. This model is particularly promising because hDPSCs have natural neurogenic potential, meaning they can differentiate into neural-like cells that are capable of mimicking the pathological features of the disease, including increased neutral lipid accumulation, which is observed in the cellular bodies of differentiated neural lineage cells. In addition, impairments in sodium channel currents are also evidenced in X-ALD differentiated cells, suggesting an alteration in the process of functional neural differentiation. These characteristics make hDPSCs a valuable resource for studying X-ALD's pathophysiology and testing potential therapeutic interventions. In addition to this model, we also have highlighted the therapeutic potential of human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs).The findings reveal that conditioned media (CM) from hBMSCs, containing EVs, can mitigate the abnormal lipid accumulation observed in X-ALD hDPSCs. Furthermore, hBMSCs protect these cells from oxidative stress and from cytotoxic effects derived from VLCFA, a condition that exacerbates cellular damage in many neurodegenerative diseases, including X-ALD. In addition to this paracrine signaling, hBMSCs also establish direct cellular communication with X-ALD hDPSCs. This direct interaction enables the transfer of healthy mitochondria and other cytosolic components from hBMSCs to the affected cells, which may help restore cellular function and potentially revert the diseased phenotype.Furthermore, through the establishment of cell-to-cell contacts, hBMSCs induce changes in sodium channel pattern of X-ALD differentiated cells, rescuing a healthy phenotype. The combined actions of direct cell-to-cell contact and indirect (paracrine) signaling suggest that hBMSCs hold significant therapeutic promise for treating X-ALD. Their ability to not only protect but also potentially correct the pathological features of the disease at the cellular level represents a substantial advancement in X-ALD research. This doctoral thesis highlights the potential of hBMSCs and cell-derived products as a therapeutic tool for X-ALD. Through the advancement in human cell models and therapeutic strategies, this thesis aims to enhance the understanding of the disease and opens new avenues for developing effective therapies. / La adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (X-ALD) es un trastorno genético raro causado por mutaciones en el gen ABCD1. Este gen codifica la proteína de la adrenoleucodistrofia (ALDP), una proteína de membrana peroxisomal crucial para el transporte de los ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA) hacia los peroxisomas, donde son degradados. En la X-ALD, las mutaciones en el gen ABCD1 provocan una disfunción de ALDP, lo que conduce a la acumulación de VLCFA en las células, afectando principalmente al sistema nervioso y glándulas suprarrenales. Esta acumulación produce una amplia gama de manifestaciones clínicas, que van desde insuficiencia suprarrenal hasta graves síntomas neurodegenerativos, incluyendo la desmielinización inflamatoria del sistema nervioso central, con consecuencias fatales. La complejidad y variabilidad en la progresión de la enfermedad, junto con las opciones terapéuticas limitadas, hacen que la X-ALD sea particularmente difícil de tratar, especialmente en los pacientes con las formas más graves de la enfermedad. Uno de los principales obstáculos para comprender los mecanismos subyacentes de la X-ALD y desarrollar tratamientos específicos es la falta de modelos animales eficaces que reproduzcan el proceso de desmielinización observado en los seres humanos. Como resultado, numerosos autores han recurrido a modelos basados en células humanas para estudiar la enfermedad. Para avanzar en la comprensión de la X-ALD y explorar nuevas opciones de tratamiento, en esta Tesis Doctoral, se ha desarrollado un nuevo modelo celular de la enfermedad utilizando células madre de pulpa dental (hDPSCs) derivadas de un paciente con diagnóstico clínico de X-ALD. Estas células proporcionan un modelo único y clínicamente relevante, ya que expresan la proteína ALDP de manera similar a las células de individuos sanos, pero exhiben una acumulación anormal de lípidos neutros, lo que refleja la disfunción de ALDP observada en la X-ALD. Debido al natural potencial neurogénico característico de las hDPSCs, las células provinientes del paciente se pueden diferenciar en células neuronales, pudiendo estudiar el fenotipo patológico de forma más precisa. De este modo, se ha podido observar que las células diferenciadas procedentes del paciente de X-ALD, no sólo presentan una acumulación aberrante de lípidos neutros, sino que también muestran alteraciones en la cinética de las corrientes de sodio, sugeriendo una alteración en el proceso de diferenciación funcional en neuronas que no sucede en células derivadas de individuos sanos. Además del desarrollo este modelo, se ha estudiado el potencial terapéutico de las células mesenquimales humanas derivadas de médula ósea (hBMSCs). Estas células son conocidas por sus propiedades terapéuticas, tanto por el establecimiento de contactos directos entre células como por la secreción de moléculas solubles como las vesículas extracelulares (EVs). En el contexto de la X-ALD, se ha investigado el efecto protector de la terapia celular con hBMSCs en el modelo celular de X-ALD desarollado en esta Tesis Doctoral. El medio condicionado (CM) derivado de las hBMSCs, rico en EVs, puede reducir la acumulación de lípidos neutros y proteger las células enfermas del estrés oxidativo y de los efectos citotóxicos derivados del exceso de VLCFAs, ambientes especialmente vulnerables en X-ALD. Además de los efectos paracrinos, las hBMSCs establecen una comunicación celular directa con las hDPSCs derivadas del paciente. Esta interacción permite la transferencia de mitocondrias y otros componentes citosólicos de las hBMSCs a las células afectadas, lo que podría ayudar a restaurar la función celular y, posiblemente, revertir el fenotipo de la enfermedad. Además, mediante el contacto directo célula-célula, las hBMSCs consiguen modificar el perfil de las corrientes de sodio de las células X-ALD diferenciadas, revertiendo el fenotipo electrofisiológico. Las acciones combinadas de contacto célula a célula e indirectas (paracrinas) sugieren que las hBMSCs tienen un gran potencial terapéutico para el tratamiento de la X-ALD. A través del avance en los modelos celulares humanos y las estrategias terapéuticas, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo mejorar la comprensión de la enfermedad y abrir nuevas vías para el desarrollo de terapias efectivas.