Modulación del canal iónico TRPA1 por la chaperona sigma 1: papel en la neuropatía periférica inducida por oxaliplatino

Abstract

El canal iónico TRP Anquirina 1 (TRPA1) es un canal catiónico polimodal que juega un papel crítico en la quimionocicepción, como sensor molecular de irritantes reactivos, estrés y daño tisular. En mamíferos, TRPA1 también ha sido considerado como un sensor de frío nocivo y de estímulos mecánicos, aunque esto aún es debatido. En el contexto del dolor neuropático, se ha demostrado, en modelos animales murinos, que el canal TRPA1 tiene un papel prominente en la hipersensibilidad al frío y la alodinia mecánica observada durante la neuropatía inducida por quimioterapia. Por otro lado, sigma 1 (σ1) es una chaperona ubicada principalmente en las membranas del retículo endoplásmico asociadas a mitocondrias (MAM) y que se encuentra ampliamente distribuida en diversos tejidos del organismo, incluyendo su expresión en las neuronas sensoriales primarias. Sigma 1 actúa como un modulador de la excitabilidad, regulando la función y el tráfico de diferentes canales iónicos de la membrana plasmática, así como en la homeostasis de la concentración del calcio intracelular. El tratamiento con S1RA, un antagonista selectivo de σ1, tiene efectos antinociceptivos en modelos animales de dolor neuropático. Sin embargo, el mecanismo molecular de estos efectos se desconoce. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la posible modulación del canal TRPA1 por σ1 en un modelo de neuropatía inducida por administración sistémica de oxaliplatino en ratones. Para explorar esta hipótesis, hemos utilizado una combinación de diferentes enfoques: evaluación de moduladores de σ1 en pruebas de comportamiento, técnicas de imagen de calcio y registros electrofisiológicos en sistemas de expresión heteróloga y en neuronas sensoriales primarias disociadas de ganglios raquídeos (DRG), así como técnicas de biología molecular y bioquímicas. En las pruebas de comportamiento, encontramos que los ratones silvestres tratados con oxaliplatino desarrollaron alodinia mecánica e hipersensibilidad al frío. Cuando los ganglios raquídeos de estos ratones fueron disociados y estudiados con imagen de calcio in vitro, las neuronas sensoriales mostraron mayores respuestas a AITC (agonista selectivo de TRPA1). También se observó un incremento en el número de neuronas que respondían a estímulos de frío, aunque este incremento no parece estar asociado a las neuronas que expresan TRPA1. Además, se observó, en contra de lo esperado, una disminución en el umbral promedio de detección de la temperatura. En contraste, los ratones TRPA1-/- tratados con oxaliplatino no mostraron hipersensibilidad al frío y desarrollaron menos alodinia mecánica en comparación con los ratones silvestres. En condiciones in vitro, las neuronas sensoriales obtenidas de ratones TRPA1-/- mostraron un incremento en el número de neuronas que respondían a frío, menor que en los ratones silvestres. En su conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con oxaliplatino modifica la actividad del canal TRPA1 y también la de otros canales iónicos sensores de frío. Además, encontramos que el comportamiento nocifensivo de los ratones en respuesta a AITC se vio disminuido por el antagonismo de σ1 con S1RA. En concreto, los ratones tratados con una inyección intraperitoneal de S1RA mostraron una disminución en las respuestas nocifencivas a la inyección intraplantar de AITC, sugiriendo una posible modulación in vivo del canal TRPA1 por σ1. Debido a que la quimioterapia es un proceso planificado, implementamos un tratamiento simultáneo con S1RA y oxaliplatino para evaluar el posible efecto preventivo del S1RA en el desarrollo de la neuropatía. Los ratones silvestres tratados simultáneamente con S1RA y oxaliplatino desarrollaron menor alodinia mecánica e hipersensibilidad al frío que los tratados únicamente con oxaliplatino. Las neuronas sensoriales obtenidas de estos ratones mostraron una menor amplitud en las respuestas de calcio intracelular al estímulo de AITC, lo que sugiere una inhibición de la actividad de TRPA1 por el tratamiento con S1RA. Además, los cambios en las respuestas a frío en condiciones in vitro, en neuronas previamente tratadas con oxaliplatino, fueron restablecidos a condiciones basales con la administración de S1RA. La medición de los cambios intracelulares de calcio en células HEK293-hTRPA1 incubadas con S1RA a diferentes concentraciones mostraron una disminución dosis dependiente en la respuesta provocada por diferentes tipos de agonistas de TRPA1 (AITC y carvacrol). Las corrientes de membrana en respuesta a AITC, en células HEK293-hTRPA1, también se redujeron después de la incubación con S1RA. S1RA no indujo cambios en la actividad de TRPA1 en una línea celular donde σ1 se encuentra silenciado (HEK293-σ1KO), lo que sugiere una modulación directa de TRPA1 por σ1. Los resultados bioquímicos de inmunoprecipitación sugirieron la formación de un complejo entre TRPA1 y σ1 cuando éstos fueron expresados en células HEK293. Debido a los déficits funcionales observados tras la incubación con S1RA, ésta podría producir una alteración en el tráfico, así como en el plegamiento y la estructura final del canal TRPA1. En resumen, estos resultados muestran que la chaperona σ1 modula la actividad del canal TRPA1 (humano y de ratón) y que el uso del antagonista de σ1, S1RA, atenúa los síntomas neuropáticos consecuencia del tratamiento por oxaliplatino, pudiendo utilizarse como una estrategia analgésica preventiva. Además, los resultados obtenidos sugieren que tanto la neuropatía inducida por oxaliplatino como los efectos de S1RA no solo afectan a la población de canales TRPA1.

The ion channel TRP Ankyrin 1 (TRPA1) is a polymodal cation channel that plays a critical role in chemonociception as a molecular sensor of reactive irritants, stress and tissue damage. In mammals TRPA1 has also been shown to be involved as a sensor of noxious cold and mechanical stimuli but this role is still a matter of debate. In the context of neuropathic pain, the role of TRPA1 channels in the development of cold and mechanical allodynia, observed during chemotherapy-induced neuropathy, is very prominent. It has been shown, in mice, that TRPA1 is involved in the exacerbated pain in this particular neuropathy. On the other hand, sigma 1 (σ1), is a chaperone mainly located at the mitochondrion-associated membrane (MAM) of the endoplasmic reticulum and is widely distributed in body tissues, including its expression in primary sensory neurons. Sigma 1 acts as an inter-organelle signaling modulator that regulates the excitability and trafficking of different ion channels and it has also been involved in the homeostasis of the intracellular calcium concentration. The treatment with S1RA, a selective antagonist of σ1, has antinociceptive effects in neuropathic pain animal models. However, the molecular mechanism of this action is still unknown. The goal in this thesis was to study the possible modulation of TRPA1 channels by σ1 in a model of chemotherapy-induced neuropathy in mice by systemic injection of oxaliplatin. To explore this hypothesis, we used different approaches: evaluation of σ1 modulators in behavioral tests, in vitro measurement of intracellular calcium changes and patch-clamp recordings in heterologous expression systems and in primary sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia (DRG) and molecular biology and biochemical techniques. Through behavioral tests, we found that wild type animals treated with oxaliplatin show mechanical allodynia and cold hypersensitivity. When the DRG from mice previously treated with oxaliplatin were dissociated, sensory neurons showed an increase in response to AITC (selective TRPA1 agonist) using in vitro calcium imaging experiments. Also, we observed an increase in the cold response under in vitro conditions, which was no dependent of TRPA1. Contrary to our expectations, we observed a decrease in the cold detection threshold to lower temperatures. In contrast, mice TRPA1-/- treated with oxaliplatin do not develop cold hypersensitivity and they develop less mechanical allodynia compared with wild type mice. The response to cold of sensory neurons in vitro condition was also increased after oxaliplatin treatment but this increment was reduced compared to wild type mice. Taken together, these results suggest that treatment with oxaliplatin modifies TRPA1 channel activity and that of other cold-sensing ion channels. Additionally, we found that pain-related behavior in response to AITC is diminished by the antagonism of σ1. Thus, mice treated with a single intraperitoneal injection of S1RA showed a decrease in the nocifensive behavior when AITC was injected intraplantarly, suggesting a possible in vivo modulation of TRPA1 by σ1. Since chemotherapy is a planned process, we implemented a simultaneous treatment of S1RA and oxaliplatin to evaluate the possible preventive effect of S1RA in the neuropathy development. Wild type mice treated with S1RA and oxaliplatin develop less mechanical allodynia and cold hypersensitivity than those treated with oxaliplatin alone. Sensory neurons cultured show a decrease in the intracellular calcium level when they are activated with AITC, suggesting an inhibition of TRPA1 by S1RA treatment. Furthermore, altered responses to cold in sensory neurons cultured from mice treated with oxaliplatin were restored to baseline levels after administration of S1RA. Measurement of intracellular calcium changes in HEK293-hTRPA1 incubated with S1RA at different concentrations show a decrease in the response evoked by TRPA1 agonists (AITC and carvacrol). Whole-cell membrane currents in HEK293-hTRPA1 cells in response to AITC were also reduced after incubation with S1RA. S1RA did not induce changes in the TRPA1 activity in a cell line where σ1 is silenced (HEK293-σ1KO), suggesting a direct modulation of TRPA1 by σ1. Also, the biochemical assays of immunoprecipitation suggested a physical interaction between TRPA1 and σ1 in HEK293 cells. Considering the TRPA1 functional deficits observed after incubation with S1RA, we can hypothesize alterations in the trafficking, folding and final structure of TRPA1 channel. In summary, these results show that the σ1 chaperone modulates TRPA1 activity (human and mouse). The use of S1RA, a σ1 antagonist, attenuates neuropathic symptoms induced by oxaliplatin treatment and it could be used as a preventive analgesic strategy. However, the results suggest that both oxaliplatin-induced neuropathy and the effects of S1RA do not only affect the TRPA1 population of channels.