Identificación molecular y morfodinámica de las fibras sensoriales de frío corneales en el ratón adulto

Abstract

Las terminaciones nerviosas periféricas de las neuronas somatosensoriales primarias que inervan la piel y las mucosas son las estructuras neurales clave en la detección y codificación de las características físicas y/o químicas de los estímulos externos, que son transformadas en señales eléctricas y enviadas al sistema nervioso central, generándose sensaciones conscientes de tacto, calor, frío o dolor. La información sensorial que genera cada tipo de terminación nerviosa viene determinada por la variedad y las características específicas de los canales iónicos implicados en la transducción y codificación del estímulo que contienen. Así, los canales iónicos TRPM8 o Piezo2 son responsables del potencial de receptor en respuesta a descensos de la temperatura ambiental y fuerzas mecánicas, respectivamente. Igualmente, otros canales iónicos dependientes de voltaje, como Nav, Cav y Kv, participan en la generación de los potenciales de acción propagados. El conocimiento actual de los canales iónicos de las neuronas somatosensoriales primarias proviene en gran medida de los experimentos realizados in vitro en el soma de la neurona y no en la terminación nerviosa, lo que no refleja las condiciones en el organismo completo. Las evidentes diferencias morfológicas entre el soma y las terminaciones nerviosas periféricas podrían explicar que la codificación de los estímulos somatosensoriales también sea diferente. Debido a esto, resulta imperativo obtener un conocimiento más detallado de la morfología de las terminaciones nerviosas. Gracias a su transparencia y alta densidad en nervios sensoriales, la córnea supone un excelente modelo experimental para la identificación de diferentes canales iónicos y la caracterización morfométrica dinámica de la inervación somatosensorial, tanto en condiciones fisiológicas como durante la degeneración y regeneración que acontece a la lesión. Por un lado, en este trabajo se realizaron procedimientos inmunohistoquímicos en córneas de ratones adultos, que permitieron la identificación de Piezo2 y Nav1.8 en terminaciones nerviosas periféricas de neuronas trigeminales nociceptoras. También se realizó la caracterización morfológica de las fibras sensoriales que expresan TRPM8, principal transductor de las neuronas termorreceptoras de frío, en el ratón Trpm8BAC-EYFP, que expresa la proteína fluorescente EYFP bajo el promotor del gen Trpm8. En paralelo, se caracterizó el patrón de expresión molecular de estas neuronas, esencial para determinar si poseen un fenotipo típico de neuronas nociceptoras. Se identificaron dos subpoblaciones de neuronas TRPM8+ en base su nivel de expresión, tanto al estudiar los somas en el ganglio trigémino como las fibras nerviosas que inervan la córnea. En dichas neuronas, se halló la expresión de marcadores moleculares propios de los nociceptores, como son el péptido CGRP, el receptor TrkA o los receptores purinérgicos P2X2 y P2X3. Por otro lado, se desarrolló un modelo experimental que permitió la monitorización in vivo a lo largo del tiempo y el posterior análisis morfométrico de las fibras y de sus terminaciones nerviosas en la córnea de ratones Trpm8BAC-EYFP adultos, tanto en condiciones fisiológicas como durante la degeneración y regeneración tras la realización de una lesión. En condiciones fisiológicas, se observó que la mayor parte de las fibras corneales TRPM8-EYFP+ experimentaban cambios morfodinámicos que no suponían un crecimiento o decrecimiento neto a lo largo de 2 semanas en lo que respecta a su longitud acumulada, al volumen que ocupan en el epitelio corneal o a su complejidad, siendo estos cambios de mayor magnitud en aquellas fibras localizadas en regiones centrales de la córnea. También se encontraron diferencias en la dinámica de remodelación de las fibras nerviosas corneales de ratones transgénicos que poseen una deleción genética del canal iónico TRPM8. Los cambios morfodinámicos experimentados por las fibras nerviosas corneales tras su lesión se estudiaron mediante dos aproximaciones experimentales. En la primera de ellas, se realizó una incisión quirúrgica de los nervios estromales de la córnea de ratones Trpm8BAC-EYFP y, a continuación, se realizó un seguimiento in vivo de los cambios morfológicos acontecidos durante las 3 semanas posteriores a la lesión. Se observó una completa degeneración nerviosa en el área lesionada, seguida de una regeneración parcial del conjunto de las fibras axotomizadas al final del periodo de seguimiento. Para la segunda aproximación, se desarrolló un nuevo modelo de lesión nerviosa muy precisa y mínimamente invasiva, basado en la fotocoagulación con un láser de femtosegundo de fibras nerviosas individuales TRPM8-EYFP y en su posterior monitorización y análisis de los cambios morfodinámicos experimentados durante su regeneración. Se encontró que las fibras axotomizadas regeneraban parcialmente, mientras que sus terminaciones nerviosas lo hacían rápidamente y de manera completa. Además, se estudió el papel de la proteína SARM1, esencial en la activación del proceso de degeneración Walleriana, durante la degeneración y regeneración, tras la lesión de los nervios periféricos en el ratón adulto. Hasta la fecha se desconoce la implicación de SARM1 en la regeneración de los axones periféricos. Con el propósito de definir su contribución, se generaron ratones Trpm8BAC-EYFP nulos para la expresión de SARM1, en los que se monitorizó la degeneración de la porción distal y la regeneración de la porción proximal tras la realización de la lesión. Se observó un retraso en la degeneración de la porción distal en el ratón knockout para SARM1, mientras que no se observaron diferencias en la dinámica de regeneración entre el ratón control y el ratón knockout. Estos resultados confirman que SARM1 es un mecanismo molecular intrínseco y específico para la activación de la degeneración Walleriana y, además, sugieren que SARM1 no afecta al proceso de regeneración intrínseca de las fibras nerviosas corneales, lo que apoyaría el uso de una inhibición de SARM1 como posible estrategia terapéutica para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas periféricas.