Caracterización de líneas transgénicas murinas para el canal iónico termosensible TRPM8: valoración funcional, expresión extraganglionar e identificación de nuevas dianas de inervación

Abstract

El canal iónico TRPM8 (“Transient Receptor Potential Melastatin 8”) se activa por descensos moderados de la temperatura y por compuestos químicos como el mentol, que evocan sensaciones de frescor. Estudios previos han demostrado su papel crucial en la detección somatosensorial del frío inocuo, aunque también se relaciona con la detección del frio nocivo y la nocicepción. Asimismo, en estudios recientes se ha asociado con la termorregulación y con la regulación del metabolismo energético. Su principal lugar de expresión se circunscribe a un subgrupo de neuronas sensoriales de pequeño tamaño, mayormente ubicadas en los ganglios raquídeos y del trigémino. Aunque se ha descrito su presencia en otros tejidos del organismo, no existe ningún estudio sistemático de su expresión, lo que ayudaría a entender su papel fisiológico. Uno de los principales impedimentos para el estudio de TRPM8 reside en la falta de buenos anticuerpos que localicen su presencia de manera clara y veraz. En este contexto, en los últimos años se han generado varios modelos transgénicos murinos que permiten la detección de su expresión mediante proteínas reporteras, y que han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de su función. En este trabajo de tesis doctoral, hemos evaluado la fiabilidad de siete líneas transgénicas de ratón que expresan reporteros fluorescentes para ubicar la expresión del canal iónico TRPM8. Algunas de estas líneas se han utilizado en trabajos de investigación previos (TRPM8-EYFP1, TRPM8-EGFPf, TRPM8-Cre, TRPM8-DTR-GFP), mientras que otras (TRPM8-EYFP2, TRPM8-EYFP3 y TRPM8-EYFP4), generadas en nuestro laboratorio, son totalmente novedosas. Hemos realizado un estudio comparativo de la expresión del reportero y de la respuesta del canal TRPM8 a fármacos moduladores de su actividad en neuronas sensoriales en las distintas líneas estudiadas. Así hemos concluido que casi todos los modelos muestran una buena correlación entre el marcaje del reportero y la expresión funcional del termorreceptor, lo que indica que constituyen unas buenas herramientas para el estudio de la anatomía y fisiología del canal. La única excepción fue la línea TRPM8-Cre, en la que demostramos una baja correlación entre expresión y función, lo que limita su utilidad. Además, la línea TRPM8-EYFP1 mostró una alta intensidad de marcaje fluorescente, que se detectó variable entre sus células. El estudio sistemático de estas diferencias nos llevó a establecer que el reportero de esta línea transgénica identifica dos subpoblaciones de neuronas termosensibles pero con características morfológicas, funcionales y niveles de expresión de TRPM8 distintos. En consecuencia, este modelo fue seleccionado para desarrollar un estudio tisular generalizado, para localizar ubicaciones de expresión e inervación de TRPM8 en emplazamientos extraganglionares. De este modo, verificamos algunas de las dianas ya indicadas en la bibliografía e identificamos algunas novedosas que estudiamos en más profundidad. Hemos estudiado en detalle la expresión del canal TRPM8 al nivel del sistema nervioso central de ratón, identificando neuronas positivas en unas pocas localizaciones, principalmente núcleos del hipotálamo preóptico, el septum y el núcleo reticular del tálamo. Estas áreas se relacionan principalmente con la termorregulación y otros procesos homeostáticos relacionados con la temperatura. Igualmente, se observó una amplia distribución de sus dianas de inervación, lo que sugiere la implicación de TRPM8 en múltiples procesos regulatorios a nivel central aún no descritos. Hemos estudiado la osmorregulación como uno de estos procesos, y hemos determinado que TRPM8 influye indirectamente en el nivel de activación del órgano vascular de la lámina terminal y del órgano subfornical, principales núcleos osmorreguladores cerebrales. Finalmente, caracterizamos la presencia del canal TRPM8 en retina. Los patrones de marcaje observados en las distintas líneas transgénicas evidenciaron su expresión en células amacrinas colinérgicas y en células ganglionares, algunas de ellas positivas para el fotopigmento melanopsina. Asimismo, se observó que las proyecciones ganglionares retinianas con marcaje llegaban a todos los núcleos cerebrales implicados en la vía visual, tanto la formadora como la no formadora de imágenes. Sin embargo, no logramos detectar su ARNm en la retina, lo que nos lleva a concluir que sus niveles de expresión en esta ubicación serían extremadamente bajos. En conclusión, en este trabajo se caracterizan nuevas herramientas moleculares para estudiar la expresión del canal TRPM8, evaluándose en profundidad algunas de las nuevas dianas detectadas. Además, los resultados permiten ofrecer una visión global de las implicaciones fisiológicas de este termorreceptor. Futuros análisis de la función de TRPM8 en estos y otros tejidos que lo expresan ayudarán a completar el rompecabezas de sus implicaciones homeostáticas.