Tratamientos pre-cosecha y post-cosecha con elicitores para la mejora de la calidad en limón ecológico

Abstract

El limón (Citrus limon (L.) Burm. F) es un fruto muy apreciado por los consumidores de todo el mundo por su apariencia, frescura, sabor y aroma característicos que lo convierten en un ingrediente imprescindible en cocina. Además, es un fruto con un elevado contenido en compuestos bioactivos con actividad antioxidante. Recientemente, se han comenzado a desarrollar diferentes estrategias pre-cosecha que mejoran los atributos de calidad de los limones en el momento de la recolección. El jasmonato de metilo (JaMe) y el ácido oxálico (AO) son compuestos presentes en las plantas de forma natural, los cuales han mostrado que utilizados en pre-cosecha mejoran la calidad postcosecha de los frutos. Sin embargo, esta estrategia debe ser complementada con otras que mantengan la mejora en la calidad conseguida con los tratamientos pre-cosecha durante las etapas de almacenamiento y comercialización. En este caso, los aceites esenciales (AEs) están formados por un conjunto de compuestos que presentan una actividad antimicrobiana elevada, y que aplicados de forma adecuada son capaces de controlar el crecimiento de los microorganismos, además son reconocidos como sustancias seguras (GRAS) para la salud y el medioambiente. Pero tienen ciertos inconvenientes, como una elevada volatilidad, baja estabilidad y poca solubilidad en agua. Por lo tanto, se han utilizado ciclodextrinas para formar complejos con estos compuestos y corregir las limitaciones mencionadas previamente. En esta Tesis Doctoral se evaluó el efecto de los tratamientos precosecha con jasmonato de metilo (JaMe) y ácido oxálico (AO) sobre la producción del árbol (kilogramos por árbol, número de frutos por árbol y peso medio de los frutos) y la calidad organoléptica (color y firmeza), nutritiva (contenido en sólidos solubles totales, (SST) y acidez total, (AT)) y funcional (contenido en fenoles totales, (CFT)) de los limones, durante el crecimiento y maduración del fruto en el árbol, en el momento de la recolección y durante 35 días de almacenamiento refrigerado. Además, también se valoró el efecto de los tratamientos pre-cosecha sobre la actividad de las enzimas antioxidantes ascorbato peroxidasa (APX), catalasa (CAT) y peroxidasa (POD), por su relación con los procesos de maduración y senescencia del fruto. Los ensayos se realizaron durante cinco años consecutivos, en el periodo 2016-2020, utilizando dos variedades, ‘Fino’ injertado sobre Citrus macrophylla y ‘Verna’ injertado sobre Citrus aurantium. Por otra parte, se seleccionaron los monoterpenos aromáticos timol y carvacrol, como los compuestos ideales para formar los complejos con hidroxipropil-β-ciclodextrinas (HP-β-CDs) utilizando dos metodologías de inclusión diferentes microondas (MO) y ‘Slurry’ (S). Para realizar estos experimentos se escogió el hongo fitopatógeno Geotrichum citri-aurantii, debido a su difícil control en las centrales hortofrutícolas por la ausencia de tratamientos efectivos. Se midió el 50 % de la dosis efectiva, la concentración mínima inhibitoria, la concentración mínima fungicida y la concentración necesaria de timol y carvacrol encapsulados en HP-β-CDs para reducir el crecimiento de G. citri-aurantii un 90 %. Finalmente, también se evaluó el efecto de aplicar timol-HP-β-CD antes (preventivo) y después (curativo) de realizar la inoculación con G. citri-aurantii en limones de la variedad ’Fino’. Se midió el efecto de este tratamiento sobre las pérdidas de peso e incidencia de podredumbres, además del CFT y la actividad de las enzimas antioxidantes (CAT, POD y APX) en el flavedo del fruto. En primer lugar se aplicaron los tratamientos pre-cosecha con los elicitores, JaMe y AO a las concentraciones 0,1, 0,5 y 1 mM, mensualmente mediante pulverización, comenzando cuando el árbol presentaba la carga total de frutos y finalizando tres días antes de la recolección en las variedades ‘Fino’ y ‘Verna’. Los resultados mostraron que la mejor concentración para JaMe fue 0,1 mM, incrementando el CFT y la actividad de las enzimas antioxidantes desde el primer tratamiento, este efecto se mantuvo durante toda la etapa de crecimiento y maduración del fruto en el árbol hasta su recolección, incluyendo el almacenamiento refrigerado, sin que la producción del árbol y los parámetros de calidad del fruto se vieran afectados. Mientras, para el AO la mejor concentración fue de 1 mM, como sucedía con JaMe, se observó un aumento del CFT y de la actividad de las enzimas antioxidantes desde el primer tratamiento hasta el final del experimento, además en este caso también se observó un efecto sobre algunos parámetros de calidad del limón en el momento de la recolección y durante el almacenamiento refrigerado, manteniendo la firmeza, el contenido en SST y la AT más elevada que los frutos que no fueron tratados. Estos efectos se consiguieron sin afectar negativamente a la producción de los árboles. Al mismo tiempo se iniciaron los experimentos con los monoterpenos aromáticos timol y carvacrol encapsulados en HP-β-CDs utilizando dos métodos MO y S, a las concentraciones 0, 2,5, 5, 12, 25 y 50 mM. Se evaluó el efecto sobre el crecimiento del hongo G. citri-aurantii y se observó que el método de inclusión más adecuado, independientemente de la concentración utilizada era el de MO, y que timol era más efectivo que carvacrol para controlar el desarrollo de G. citri-aurantii. Se pudo concluir que el complejo formado con timol-HP-β-CD a concentraciones superiores a 6 mM disminuía el crecimiento del hongo más de un 90 %. Además, se observó que los complejos formados con timol, carvacrol y las ciclodextrinas fueron capaces de mantener su efectividad controlando el crecimiento del hongo durante aproximadamente el doble de tiempo que cuando se aplicaban los compuestos puros. Tras los resultados observados previamente, se seleccionó el complejo timol-HP-β-CD a las concentraciones 25 y 50 mM para iniciar un experimento post-cosecha con limón de la variedad ‘Fino’. Los limones fueron tratados con timol-HP-β-CD antes (preventivo) y después (curativo) de ser inoculados con G. citri-aurantii, además se incorporó un tercer tratamiento con propiconazol, el único compuesto comercial recomendado para el control de G. citri-aurantii en aquel momento. Los resultados mostraron que aplicado de forma preventiva, el tratamiento más efectivo para controlar el crecimiento del hongo era timol-HP- β-CD a la concentración 50 mM, con una reducción aproximada del 60 % en la incidencia de podredumbres y un 30 % en la severidad de los síntomas respecto a los frutos sin tratamiento. Las menores pérdidas de peso se observaron en los limones tratados con timol-HP-β-CD 50 mM, lo que se pudo relacionar con una reducción en la tasa de respiración de aproximadamente un 55 % respecto a los controles. Finalmente, el CFT y la actividad de las enzimas antioxidantes (CAT, POD y APX) también fueron superiores en los limones que habían sido tratados con timol-HP-β-CD 50 mM. Por lo tanto, los tratamientos con JaMe y AO podrían ser aplicados en pre-cosecha con el objetivo de mejorar los parámetros de calidad y las propiedades antioxidantes de los limones en el momento de la recolección y durante el almacenamiento refrigerado. Al mismo tiempo, si se aplica timol-HP- β-CD en post-cosecha se podría mantener ese mejor estado inicial del fruto durante más tiempo, a la vez que se limita el ataque de patógenos de origen fúngico. Estos resultados se han publicado en Journal of the Science of Food and Agriculture (Serna-Escolano y col., 2019), Journal of Food Science (Serna- Escolano y col., 2019), Molecules (Serna-Escolano y col., 2020) y Antioxidants (Serna-Escolano y col., 2021)

Lemon (Citrus limon (L.) Burm. F) is a fruit highly appreciated by consumers around the world for its characteristic such as appearance, freshness, flavor and aroma that make it an essential ingredient for cooking. Besides, it is a fruit with many bioactive compounds and with high antioxidant activity. Recently, different pre-harvest strategies have been developed for improving the quality attributes of lemons at harvest time. Methyl jasmonate (MeJa) and oxalic acid (OA) are compounds naturally present in plants, which improve the post-harvest quality of the fruits when are used in pre-harvest. However, this strategy must be complemented with others that maintain the improvement in quality achieved with the pre-harvest treatments during the storage and commercialization stages. Essential oils (EOs) are made up of a set of compounds that have high antimicrobial activity and that are capable of controlling the growth of microorganisms when are applied properly. But they have certain drawbacks, such as high volatility, low stability and poor solubility in water. Therefore, cyclodextrins have been used to complex these compounds and correct the previously mentioned limitations. In this Doctoral Thesis, the effect of the pre-harvest treatments with methyl jasmonate (MeJa) and oxalic acid (OA) on the yield of each tree (kilograms per tree, number of fruits per tree and average weight of the fruits) was evaluated. Also, the organoleptic (colour and firmness), nutritional characteristics (total soluble solids, (TSS) and total acidity, (TA)) and functional quality (total phenolics content, (TFC)) of the fruit during 35 days of storage at 10 ºC were measured. Besides, it was evaluated the effect of pre-harvest treatments on the activity of the antioxidant enzymes ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT) and peroxidase (POD), related to the ripening and senescence processes of the fruit. The experiments were carried out for five consecutive years, in the period 2016-2020, using two varieties: 'Fino' grafted on Citrus macrophylla rootstock and 'Verna' grafted on Citrus aurantium rootstock. On the other hand, the aromatic monoterpenes thymol and carvacrol were selected as the best compounds to take part in the complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrins (HP-β-CDs) using two different inclusión methods: microwave (MW) and 'Slurry' (S). The phytopathogenic fungus Geotrichum citri-aurantii was chosen to carry out these experiments due to the lack of effective treatments to control it. In these experiments the 50% of effective dose, the minimum inhibitory concentration, the minimum fungicidal concentration and the necessary concentration of thymol and carvacrol encapsulated in HP-β-CDs to reduce the growth of G. citri-aurantii by 90% were measured. Finally, the effect of applying thymol-HP-β-CD before (preventive) and after (curative) the inoculation with G. citri-aurantii in 'Fino' lemon fruits was observed. These effects were evaluated by measuring weight loss and incidence of rotting, functional (CFT) and antioxidant (APX, CAT and POD enzymes) quality of fruit. The pre-harvest treatments were applied by spraying using the elicitors MeJa and OA at concentrations 0.1, 0.5 and 1 mM, starting when the tree had the final load of fruits (after the physiological drop) and ending three days before harvest in 'Fino' and 'Verna'. The results showed that the best concentration for MeJA was 0.1 mM, increasing the CFT and the activity of the antioxidant enzymes from the first treatment. This effect was maintained throughout the growth and maturation stages on tree including harvesting and the storage period at 10 ºC. However for OA the best concentration was 1 mM, increasing the CFT and the activity of the antioxidant enzymes from the first treatment to the end of the experiment. Fruits from OA treated trees had better quality parameters at harvest and during storage at 10 ºC, maintaining the firmness, the TSS and the TA higher than the untreated fruits. These effects were achieved without affecting negatively the production of the trees. The effect of applying the EOs-HP-β-CDs at 0, 2.5, 5, 12, 25 and 50 mM on the growth of G. citri-aurantii was evaluated. The most effective inclusión method was MW, and thymol was more effective than carvacrol to control the development of G. citri-aurantii. It could be concluded that thymol-HP-β-CD at concentrations higher than 6 mM decreased the growth of the fungus more than 90 %. Furthermore, it was noted that thymol and carvacrol encapsulated were able to maintain their effectiveness by controlling the growth of the fungus for approximately twice as long as when the pure compounds were applied. Thymol-HP-β-CD was applied by spraying at concentrations of 25 and 50 mM and fruits were treated before (preventive) and after (curative) being inoculated with G. citri-aurantii. Furthermore, propiconazole was included in the experiment as a commercial solution for the control of fungi. The results showed that the most effective treatment to control the development of the G. citriaurantii was thymol-HP-β-CD at 50 mM, decreasing a 60 % of rot incidence and reducing the severity of symptoms a 30 % compared to the others treatments. The lowest weight losses were observed in fruits treated with thymol-HP-β-CD 50 mM, which could be related to a 55 % reduction in respiration rate. Finally, the TFC and the activity of the antioxidant enzymes (CAT, POD and APX) were also higher in the flavedo of fruits treated with thymol-HP-β-CD 50 mM. MeJA and OA treatments could be applied in pre-harvest in order to improve the quality parameters and antioxidant properties of fruit at harvest and during storage. On the other hand, thymol-HP-β-CD applied in post-harvest, could be an effective strategy to maintain the quality of fruit for a longer period, reducing the incidence of phytopathogenic fungi. These results have been published in the Journal of the Science of Food and Agriculture (Serna-Escolano et al., 2019), Journal of Food Science (Serna- Escolano et al., 2019), Molecules (Serna-Escolano et al., 2020) and Antioxidants (Serna-Escolano et al., 2021)