Adaptaciones de la célula α pancreática durante el final de la gestación en el ratón: papel de las hormonas gestacionales

Abstract

El embarazo representa un gran reto metabólico para la madre. El desarrollo de una resistencia a la insulina fisiológica en tejidos periféricos hacia el final de la gestación, requiere múltiples adaptaciones por parte de los islotes de Langerhans para preservar la normoglucemia. Estas adaptaciones, muy bien caracterizadas en las células β pancreáticas, implican un aumento de la función y de la masa de este tipo celular, con el fin de mantener un equilibrio energético y de nutrientes óptimo entre la madre y el feto. Sin embargo, a pesar de la importancia de las células α en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa, así como de los estudios publicados que parecen vincular alteraciones en la secreción de glucagón con el desarrollo de la diabetes gestacional, el conocimiento sobre las posibles adaptaciones de las células α pancreáticas y su regulación durante el embarazo es virtualmente inexistente. Para investigar las características morfo-funcionales de las células α pancreáticas durante el embarazo, se utilizaron ratonas C57BL/6 preñadas, y ratonas no preñadas como control. Inicialmente, se estudiaron las adaptaciones morfológicas in vivo en diferentes etapas de la gestación (día gestacional (G): 12.5, 15.2 y 18.5). Dado que la mayor parte de cambios significativos a nivel morfológico se observaron en el día de gestación G18.5, se decidió finalmente centrar el estudio en esta etapa de la gestación que correspondería con el final de la gestación en el ratón. Además, se llevó a cabo el aislamiento de islotes de Langerhans frescos para los estudios ex vivo. Para los análisis in vitro, se utilizó la línea celular secretora de glucagón (α-TC1.9) para evaluar el papel potencial de las hormonas gestacionales en la regulación de estas adaptaciones. Para estudiar las características morfológicas se realizaron experimentos de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, mientras que para las características funcionales se determinaron los niveles de hormonas plasmáticas mediante ELISA, la secreción estática de glucagón y el contenido empleando también la técnica de ELISA, la señalización de calcio intracelular para estudiar alteraciones en el acoplamiento estímulo-secreción mediante microscopía confocal y la expresión génica del mRNA de glucagón mediante PCR cuantitativa. En cuanto a las adaptaciones morfológicas en las ratonas preñadas G18.5, los resultados obtenidos muestran un aumento estadísticamente significativo del área y masa de células α así como hipertrofia celular. Estos cambios en la masa se asociaron también a un aumento en la proliferación. No se encontraron cambios en la apoptosis de células α, neogénesis ductal o transdiferenciación entre células α y β, en comparación con los controles. Por otro lado, los experimentos in vitro en la línea celular α-TC1.9 sugieren que el lactógeno placentario y la prolactina pueden participar en la expansión de las células α, promoviendo un aumento en la proliferación, mientras que el estradiol actuaría de forma opuesta. Por lo que respecta a la función de la célula α durante la gestación, también observamos diversos cambios significativos. En el día gestacional G18.5, las ratonas preñadas presentan una marcada hipoglucagonemia, en comparación con las ratonas control. Además, la secreción in vitro de glucagón presentó una inhibición en presencia de niveles bajos de glucosa (0.5 mM) en los islotes recién aislados de estos animales. Igualmente, el contenido de glucagón en los islotes se vio afectado negativamente. El tratamiento in vitro durante 8 días con las hormonas gestacionales (PL, PRL y E2) produjo efectos similares en las células α-TC1.9, disminuyendo la liberación de glucagón a 0.5 mM G. Estos resultados indicarían un posible papel de estas hormonas en la regulación de la función de las células α durante el embarazo. Además, la expresión del gen del mRNA de glucagón se vio afectada en las células α-TC1.9 tratadas con E2, revelando una vez más, la posible participación de esta hormona en particular, en los cambios adaptativos de las células α durante la gestación. En conclusión, las células α pancreáticas presentan importantes adaptaciones tanto morfológicas como funcionales hacía el final de la gestación en ratones, potencialmente mediadas por las hormonas gestacionales. Estas adaptaciones podrían contribuir al mantenimiento de una homeostasis normal de la glucosa, impidiendo el establecimiento de un ambiente hiperglucémico que podría favorecer al desarrollo de diabetes mellitus gestacional.

Pregnancy represents a major metabolic challenge for the mother. The development of a physiologic insulin resistance requires multiple adaptations in the islets of Langerhans to preserve a normoglycaemic state. These adaptations are very well characterized in the pancreatic beta-cells and involve an enhancement of both function and cellular mass to maintain an optimal energetic and nutrient balance between the mother and the fetus. However, despite the importance of the alpha-cells in the maintenance of glucose homeostasis and the studies that link changes in these cells to the development of gestational diabetes, the knowledge about the potential adaptations of the alpha-cell and its regulation during pregnancy is scarce. To investigate the morphofunctional features of pancreatic alpha-cells during pregnancy, we used pregnant C57BL/6 mice and non-pregnant mice as controls. Initially, the in vivo morphological adaptations were studied at different gestational days: G12.5, G15.5 and G18.5). Keeping in mind that, most of the morphological changes took place at G18.5, we finally decided to focus the present study on this gestational stage in particular, the late pregnancy in mice. In addition, freshly isolated islets of Langerhans were obtained to perform the ex vivo experiments. For the in vitro analysis, the glucagonsecreting α-cell line α-TC1.9 was used to assess the potential role of pregnancy hormones in the regulation of these adaptations. For the analysis of the morphological features, we performed immunohisto- and immunocytochemical experiments, while the study of the functional features was performed by different approaches: plasma hormone levels, glucagon secretion and glucagon content were measured by ELISA, calcium signaling to study alterations in the stimulus-secretion coupling was recorded using confocal microscopy and glucagon mRNA gene expression was measured by quantitative PCR experiments. Pregnant mice at G18.5 exhibited augmented alpha-cell area and mass as well as cell hypertrophy. This change in cell mas was also associated with increased proliferation. No changes in alpha-cell apoptosis, ductal neogenesis, or alpha-to-beta transdifferentiation were found compared with controls. The experiments with the α- TC1.9 cell line suggested that placental lactogen and prolactin may be involved in the expansion of the alpha-cell, promoting an increase in proliferation, while estradiol reduce the proliferation rate. At G18.5, pregnant mice presented hypoglucagonaemia compared to controls. Additionally, in vitro glucagon secretion at low glucose levels (0.5 mM) was impaired in freshly isolated islets from these animals. Glucagon content was also found to be reduced. Treatment for 8 days with the pregnancy hormones (PL, PRL and E2) produced similar effects in α-TC1.9 cells, decreasing glucagon release at 0.5 mM G, further indicating a possible role for these hormones in the regulation of alpha-cell function during pregnancy. Moreover, glucagon mRNA gene expression was impaired in α-TC1.9 cells treated with E2, revealing the potential involvement of this particular hormone in the adaptive changes in alpha-cells during gestation. In conclusion, pancreatic alpha-cells present several morphological and functional adaptations during late pregnancy in mice, potentially mediated by pregnancy hormones. These adaptations may contribute to the maintenance of a normal glucose homeostasis, preventing a hyperglycemic milieu, which could promote the development of gestational diabetes mellitus.